آشنایی با تکنیک RNA-Seq در سنجش بیان ژن ها، توالی یابی RNA، کشف واریانت ها و ژن های جدید

روش RNA-Seq چیست ؟

RNA-Seq یک تکنیک ابتکاری است که مطالعات ترانسکریپتوم را بر اساس تکنولوژی های نسل جدید توالی یابی انجام می دهد و بر بسیاری از مشکلات ریز ارایه غلبه می کند. توالی یابی نمودن داده می تواند باعث آنالیز مجدد اگزون-هایی که جدیداً کشف شده اند شود. در حالی که نمونه ها بر روی یک ریزآرایه با کاوشگرهای به روز، مجددا بایستی آنالیز شوند RNA-Seq به طور گسترده وابسته به ابزارهای بیوانفورماتیکی توسعه یافته جهت پشتیبانی در مراحل متفاوت پردازش داده ها است. تکنولوژی RNA-Seq می تواند در تشخیص صفات اپی ژنتیک کمک کننده باشد. اپی ژنتیک، مطالعه تغییرات برگشتپذیر در بیان ژن ها است که از طریق تقسیمات میتوز، میوز و یا هر دو، قابل وراثت بوده و تغییر در توالی DNA را شامل نمی شود. گام نهایی توالی یابی RNA به عنوان RNA-seq شناخته میشود و از محدودیت های تکنولوژی های قبلی از قبیل وابستگی اولیه به دانش در مورد ارگانیسمها که در روش ریز آرایه و PCR نیاز است، عاری است.

توضیح روش و مراحل انجام روش RNA-seq

شکل فوق مراحل تکلیک RNA Seq به طور نمونه. ابتدا RNAهای بلبلد به کتابخانه cDNA با قطعات RNA یا DNA تبدیل می شوند. آداپتورهای توالی یابی (به رنگ قرمز متصل به کتابخانه DNA) متعاقباً به قطعات و توالیهای کوتاه CDNA که به دست آمده اند، اضافه می شوند. سپس قطعات با استفاده از تکنولوژی توالی یابی با توان بالا (NGS) توالی یابی شده و سپس خوانش های هر قطعه نسبت به توالی ژنوم مرجع یا ترانسکریپتوم مرجع هم ردیف می شوند تا منشا هر قطعه شناسایی شود و سپس تعداد هر قطعه به صورت کمی گزارش می شود که بیانگر میزان بیان ژن مرجع می باشد.

آشنایی با مزیت ها و کاربردهای روش RNA-Seq چیست

RNA-Seq یک روش قدرتمند بر پایه ی توالی یابی است که محققان را قادر می سازد تا توالی یابی و کمیت رونوشت های RNA رادریک محصول کامل بیان ژن (ترانسکریپتوم) تعیین کنند. این تکنیک برای بررسی ژنوم تازه توالی یابی شده و شناسایی ژن های جدید یا ایزوفرم های آن در موجوداتی که تفسیرات ژنی هنوز ناکامل مانده بسیار ارزشمند است. ضمنا به ما امکان میدهد تا فعالیتهای ژنی را در بافت های مختلف ارگانیسمها، مراحل و یا تحت شرایط گوناگون بررسی کنیم.

مقایسه روش RNA-Seq با روش میکرواری (microarray). مزیت های روش RNA-Seq در مقایسه با با روش میکرواری (microarray) در چیست؟

RNA-Seq در مقایسه با ریز آرایه ها در یک لحظه تقریباً تصویر تمامی رونوشتهای بیان شده را ضبط کرده در حالیکه ریزآرایه تنها تکیه بر اطلاعات پیشین دارد. از این رو قادر به شناسایی متغیرهای اسپلایسینگ، ژنها و رونوشتهای جدید نیست. تکنیک – RNA Seq احتیاجی به کاوشگر و آغازگر ندارد و دادههای کاملاً نااریب و توانایی تجزیه و تحلیل آن، کشف رونوشت را که در روشهای سنتی بر اساس ریز آرایه امکان پذیر نیست فراهم می کند. به علاوه RNA-Seq در تجزیه و تحلیل بیان ژن می تواند رونوشت های جدید، ایزوفرم های جدید، مکانهایی که اسپلایسینگ به طور متناوب در آنها رخ داده ، RNAهای غیر کد کننده طویل (IncRNAs) ، بیان در آلل خاص، رونوشتهای کمیاب و متغیرهای تک نوکلئوتیدی در اگزونهای بیان شده در یک تک آزمایش را شناسایی کند RNA-Seq برخلاف ریزآرایه ها کارایی در اندازهگیری شدت کاوشگر پیوسته، کمی نمودن بیان ژنها و رونوشتها ، یافتن الحاق های ژنی، توالی یابی دیجیتال جهت ردیف کردن خوانشها را نیز دارد. طبیعت دیجیتال این پروسه با ایجاد یک دامنه ی نامحدود پویا، محققان را قادر میسازد تا بیان کمی RNAها را با تفکیک پذیری بالا مورد بررسی قرار دهد و برای دستیابی به تغییرات ظریف بیان ژن که به فرآیندهای بیولوژیکی وابسته اند اهمیت دارد. کاوشگرهای استاندارد ریزآرایه فقط بیش از ۲۰٪ از میانگین یک ژن را پوشش می دهند و به طور بیولوژیکی فقط به یک بخشی از داده مربوطه دستیابی دارند، در حالی که RNA-Seq یک پروفایل از رونوشت کامل است. علاوه بر این، RNA-Seq اختلال پایین، حساسیت بالا و در نمونه هایی با میزان کم RNA کارایی قابل توجه دارد. این تکنیک توانایی درک بهتر پیچیدگی ها و دید کلی بی سابقه از ترانسکریپتوم در گونه های مختلف را برای ما فراهم می کند. تکنولوژیRNA-Seq چندین مزیت بیشتر نسبت به ریز آرایه دارد که در جدول ۱، این دو روش باهم مقایسه شده اند.

معایب روش RNA-Seq چیست

اگرچه تکنیک RNA-Seq فواید شگرفی به همراه داشته است ولی چالش های زیادی بین تکنولوژی های توالی یابی و تجزیه و تحلیل داده های بیوانفورماتیک وجود دارد. با این همه کتابخانه ژنومی حاصل از RNA-Seqi دارای اریب بوده و کتابخانه های رشته ای خاصی که اهمیت زیادی در جهتیابی رونوشت ها دارند، هنوز به اسانی ایجاد نشده اند. به علاوه این تکنیک مقادیر زیادی داده تولید میکند و به طور کلی طول خوانش ها کوتاه و دارای خطاهای توالی یابی هستناد. به طور کلی این قبیل چالشها مرتبط با روشها و الگوریتم های تأثیرگذار در تحلیل داده های RNA-Seq است. اهمیت توالی های ژنوم مرجع برای مطالعات RNA-Seq بسیار زیاد است زیرا آنها الگوهای لازم برای نقشه یابی خوانش ها و تفسیرهای مرتبط بر الگوریتمهای لازم برای آنالیز بهینه ی نتایج را فراهم می کنند

آشنایی با کاربردهای داده های حاصل از روش RNA-Seq

توضیح کاربرد تکنیک RNA-Seq در نوسازی ترانسکریپتوم ترانسکریپتوم

مجموعه ای از RNA تولید شده (کد کننده و غیر کد کننده) در یک یا جمعیتی از سلول است که روش کاربردی و محسوس در تهیه آن، تکنیک RNA-Seq است. در حال حاضر، عمدتاً ۲ دسته استراتژی به منظور ساخت ترانسکریپتوم موجود است.

روش genome-guided ابتدا نقشه تمامی ریدهای توالی یابی شده ی ترانسکریپتوم تهیه و سپس ریدهای ردیف شده بر اساس اطلاعات نقشه یابی آنها به داخل رونوشت ها یا قطعات، سرهم می شوند.

روش genome-independentبدون نیاز به ژنوم مرجع، ریدها را مستقیم به داخل رونوشت ها سرهم می کنند.

توضیح کاربرد تکنیک RNA-Seq در بررسی محل اتصال اسپلایسینگ اگزون – اگزون و کشف واریانت های جدید یک ژن

اسپلایسینگ متناوب یک پدیده رایج در روند رونویسی ژنی است و اهمیت به سزایی در ساخت RNAهای ژنوم (کد کننده پروتئینی و غیر پروتئینی) دارد که کارکرد طبیعی اندام ها را نیز تضمین می کند (۸). در حال حاضر، تعداد مدلهای موجود که به خوبی اتصال اسپلایسینگ اگزون – اگزون را تفسیر کنند بسیار کم بوده و از طرفی بخش عمده ژنوم گونه ها هنوز توالی یابی نشده است. تراپنل و همکاران (۲۰۱۰)، با استفاده از آنالیز دادههای RNA-Seq حاصل از لاین سلولی مایوبلاست موش هزاران رونوشت تفسیر نشده یافتند. مطالعات گاتمن و همکاران (۲۰۱۰)، بیش از هزار RNAهای غیر کدکننده بین ژنی بزرگ را از توالی یابی ترانس کریپتوم سلولهای بنیادی رویان موش شناسایی کردند. علاوه بر این، شناسایی محل اتصال اسپلایسینگ بین اگزون ها برای درک ایزوفرم های ژنی و کمی نمودن بیان ژن و ایزوفرم های آن بسیار حیاتی است (۸). جهت شناسایی محل اتصال اسپلایسینگ بین اگزون ها، در ابتدا بایستی یکسری نرم افزارها نقشه یابی قسمت های اتصال یافته ی خوانشها را انجام داده و سپس خوانش های موجود در محل اتصالات اسپلایسینگ به قطعات کوچکتر جدا شده تا نقشه اگزون های متفاوت با اینترون ها امکانپذیر شود.

توضیح کاربرد تکنیک RNA-Seq در سنجش بیان ژن و واریانت آن ها

قبل از تکنولوژی های RNA-Seq ریزآرایه ها تکنولوژی غالب برای بررسی پروفایلهای بیان ژن به شمار میآمدند اگرچه آنها در کمی نمودن بیان ژن فقط محدود به سطح ژن بودند. در مقابل، RNA-Seq می تواند بیان ژن را در هر دو سطوح ژن و ایزوفرم های آن ارزیابی کند. بسیاری از ژنهای چند اگزونی قادرند ایزوفرمهای چندگانه با نقش های مختلف در خلال بیان ژن بسازند. مطالعه در سطوح ایزوفرمهای ژنها به منظور درک بهتر پیچیدگی های ترانسسکریپتوم ضروری است, RNA-Seq قابلیت شناسایی ژنهای تفسیر نشده و ایزوفرم های آن را برای هر گونه دارند در حالی که ریزآرایه ها تنها قادر به شناسایی ژن های شناخته شده بر اساس اطلاعات پیشین اند.

کاربرد تکنیک RNA-Seq در آنالیز بیان ژن ها در نمونه های مختلف

ژن های یوکاریوتی تحت شرایط مختلف و تامین نیاز موجودات، چندین ایزوفرم متمایز را نشان خواهند داد. با تعیین تغییرات بیان ژن ها یا ایزوفرم های آن بین ۲ نمونه یا گام متفاوت، انجام آنالیزهای بیانی متفاوت جهت شناسایی ژنها یا ایزوفرم های بیان شده امکان پذیر خواهد شد. از دادههای RNA-Seq میتوان جهت آنالیز بیانی متفاوت استفاده نمود، زیرا نسبت به ریز آرایه ها دارای فواید بیشتر، ارزانتر و بررسی بیان ژن در سطوح ژنی و ایزوفرم های آن است در حالی که ریز آرایه ها ایزوفرم های ژن را بررسی نمیکنند. سطح بیان ژن یا رونوشت ها در RNA-Seq به تعداد خوانشهای سازمان یافته ولی در ریز آرایه ها به انعکاس نور فلورسنتی پس از هیبریداسیون وابسته است. اگر بین شمارش خوانش های ژن یا رونوشت آن در ۲ وضعیت آزمایشی متفاوت تفاوت آماری معنی دار وجود داشته باشد، میتوان آنالیز بیانی متفاوت را در دادههای RNA-Seq تعیین کرد، اگرچه در این حالت دادههای RNA-Seq اریب هایی از قبیل عمق توالی یابی، محاسبه پراکندگی در نمونه های مختلف و طول ژن یا رونوشت دارند. ضمناً محاسبه پراکندگی در میان نمونه ها دارای تفاوت هایی است. علاوه براین، نسبت رید کانت ها برای رونوشتهای وابسته برابر با طول رونوشت ضرب در سطوح بیانی RNA مرتبط آن است. برای تعیین ژنها یا ایزوفرم های بیان شده متمایز بایستی اریب های RNA-Seq به درستی مورد بررسی قرار گیرد.

Summary

Reviewer

pishgam-bio

Review Date

2018-01-28

Author Rating

5