آموزش انواع پروب های (probs) فلورسنت مورد استفاده در روش ریل تایم (real time PCR)

پروب های مورد استفاده در روش ریل تایم شامل: Molecular Beacons , TaqMan Probes FRET Hybridization Probes و Scorpion Primers می باشند.

آموزش پروب های Taqman در روش روش ریل تایم (real time PCR)

اساس اين روش خاصيت 5′ Exonuclease Activity آنزيم Taq DNA Polymerase مي باشد.

يك Reporter در انتهاي 5 و يك Quencher درانتهاي 3 وجود دارد. در انتهاي 3 يك بلاكر هم وجود دارد ) اين بلاكر باعث مي شود كه پروب به عنوان پرايمر استفاده نشود (. پروب حدود چندباز بعد از انتهاي 3 يكي از پرايمرها (Forward) طراحي مي شود.طول اين پروب 21 تا 31 نوكلئوتيد مي باشد.

آنزيم پس از نزديك شدن به پروب با استفاده از خاصيت 5′ Exonuclease Activity آن راتجزيه مي كند. وقتي پروب تجزيه شد ماده Reporter از تأثير Quencher خارج شده واز خود فلورسانس ساطع مي كند. در هر سيكل با آزادشدن بيشتر Reporter ماده فلورسانس بيشتري ساطع گرديده و توسط دستگاه ثبت مي شود.

آموزش پروب های Beacon در روش روش ریل تایم (real time PCR)

اين پروب نيز همانند پروب Taq Man در اتهای 3 و 5 پریم داراي رنگ بوده اما برخلاف Taq Man تجزيه نمي شود و در سيكلهاي بعدي دوباره مورد استفاده قرار مي گيرد.

اين پروب قبل از اتصال به DNA به صورت لوپ است كه به آن Stemloop structure مي گويند. به علت نزديكي Reporter و Quencher نور ساطع شده توسط Quencher مهار مي شود. پس از اتصال پروب به محل موردنظر خود، ساختا ر Stemloop باز و در نتيجه رنگها از هم دور مي شوند كه نتيجه اين امر تابش نور از Reporter است.

آموزش پروب های scorpions در روش روش ریل تایم (real time PCR)

توالي پروب طوري طراحي شده كه مكمل تعدادي از نوكلئوتيدها بعد از پرايمر forward است. دو طرف پروب شامل توالي شش نوكلئوتيدي است كه در دماي محيط ايجاد duplex مي نمايد. انتهاي 5 ساقه به صورت كووالان به Reporter و انتهاي 3 به Quencher متصل مي باشد. هنگامي كه پروب به صورت duplex است، نور ساطع نمي شود. يك بلاكر نيز از تكثير پروب توسط پرايمر Reverse در چرخه بعدي PCR جلوگيري مي كند.

جهت گيري پروب به صورتي است كه انتهاي 5آن مكمل انتهاي 3تارگت مي باشد. در طول سيكلهاي PCR، همزمان با اتصال پرايمرها، لوپ پروب باز و به قسمت تكثيرشده از چرخة قبل متصل مي شود و در نتيجه به علت جداشدن Reporter از Quencher نور ساطع مي شود. در مرحلة بعد پروب از Template جداشده و به حالت خاموش در مي آيد. به اين ترتيب در هر annealing با افزايش محصول PCR مقدار فلورسانس نيز افزايش مي يابد

آموزش پروب های Fret در روش روش ریل تایم (real time PCR)

در اين سيستم پروب به صورت دو قطعه مختلف طراحي مي شود. فلورسانت در انتهاي 5 يك پروب و فلورسنت دیگری نیز و در انتهاي 3 پروب دیگر قرار دارد. وقتي كه ا ين دو دقيقاً درمحل موردنظر خودشان بچسبند نزد يكي فاصله ا ين دو ماده باعث واكنشي به نام FRET مي شود. انتخاب رنگها در اين پروب به صورتي است كه طول موج ساطع شده از یک فلورسنت به عنوان محرك ماده فلورسنت دوم عمل مي كند. بنابراین پس از چسبيدن دو پروب بر روی محصولات اين رنگهای فلورسنت به هم نزديك شده و فلورسانس ساطع شده قابل اندازه گيري است. طراحي اين پروبها به نحوي است كه در صورت تفاوت حتي در يك نوكليوتيد پروب به DNA متصل نمي شود.يكي از كاربردهاي اين پروب ها در تشخيص SNP مي باشد. در موتاسيونهاي نقطه اي چون باز جهش يافته مكمل باز مورد نظر در پروب نيست اتصال صورت نمي گيرد.