آموزش نرم افزار LinRegPCR : در این بخش محاسبه کارایی PCR و پرایمرها ( E یا PCR Efficiency) در آنالیز داده های ریل تایم آموزش داده خواهد شد

آنالیز داده های ریل تایم: محاسبه کارایی PCR و پرایمرها  با استفاده از نرم افزار LinRegPCR

ضرورت محاسبه کارایی پرایمرها ( E یا PCR Efficiency):

برای توضیح ضرورت بررسی کارایی پرایمرها ابتدا باید با مفهوم fold change و نحوه محاسبه آن از نتایج ریل تایم آشنا شوید.

آشنایی با مفهوم Fold change در ریل تایم

در واکنش ریل تایم هنگامی که میزان بیان یک ژن را در چند گروه مقایسه می نماییم بهترین راه بیان میزان تغییرات آن ژن در یک نمونه نسبت به نمونه دیگر fold change می باشد. مفهوم fold change همان “چند برابر” می باشد، به عبارت بهتر بیان ژن مورد نظر در نمونه های گروه اول (به عنوان مثال نمونه های سرطانی) نسبت به نمونه های گروه دوم (به عنوان مثال نمونه های نرمال) چند برابر افزایش و یا کاهش یافته است؟ این جمله به این مفهوم است که اگر بیان ژن مورد بررسی را در نمونه نرمال برابر 1 در نظر بگیریم، بیان آن در نمونه سرطانی برابر چه میزانی خواهد بود؟

قبل از توضیح محاسبه fold change در real time به این مثال توجه فرمایید وزن فرد A برابر 60 کیلوگرم و وزن فرد B برابر120 گیلوگرم است، پس Fold change وزن فرد B نسبت فرد A برابر است با 2 برابر (120 تقسیم بر 60).

در روش ریل تایم برای محاسبه fold change از فرمول 1 استفاده می شود.

فرمول 1: فرمول محاسبه fold change در ریل تایم. در این فرمول target برابر است با ژن مورد بررسی و ref برابر با ژن رفرنس می باشد. Control و sample نیز گروه های مورد بررسی می باشند.

در فرمول فوق از عدد 2 در فرمول استفاده شده است چرا؟ به دلیل اینکه در واکنش ریل تایم (همانند واکنش PCR) میزان محصولات در هر سیکل 2 برابر می شود.

حال اگر میزان -∆∆CP برابر با 3 باشد، میزان fold change برابر با 2 به توان 3 و برابر با 8 می باشد.

آشنایی با مفاهیم کارایی پرایمرها ( E یا PCR Efficiency) در real time PCR

استفاده از فرمول 1 برای محاسبه fold change در شرایطی صحیح است که میزان کارایی پرایمرها برابر با 100درصد باشد. 100درصد بودن کارایی پرایمرها به این معنی است که محصولات ریل تایم در هر سیکل از واکنش، 2 برابر می شوند، اما همیشه این گونه نیست و در بسیاری از موارد کارایی پرایمرها از 100درصد کمتر است بنابراین نمی توان از عدد 2 در فرمول 1 استفاده نمود. به عنوان مثال اگر کارایی پرایمرهای ژن هدف و ژن کنترل داخلی برابر با 80درصد باشد بنابراین در فرمول 1 به جای عدد 2 باید از عدد 1.8 (1+0.8) استفاده نمود. بنابراین fold change برابر با 1.8 به توان 3 و مساوی 5.8 خواهد بود.

همانگونه که در مثال فوق مشاهده نمودید، با محاسبه کارایی پرایمرها در واکنش ریل میزان fold change صحیح محاسبه گردید. بنابراین با محاسبه کارایی پرایمرها فرمول 2 به فرمول 3 اصلاح خواهد شد.

فرمول 2: فرمول اصلاح شده محاسبه fold change در ریل تایم

در فرمول شماره 2 مقدار E جایگزین عدد 2 (در فرمول 2( شده است که E برابر با کارایی PCR (PCR Efficiency) برای ژن های هدف و رفرنس می باشد. E برابر است با 1 به علاوه میزان کارایی پرایمرها (فرمول 3).

فرمول 3: نحوه محاسبه E.

در فرمول 3 کارایی پرایمرها بین 100درصد (عدد 1) تا صفر درصد (عدد 0) متغیر می باشد. بنابراین میزان E بین 2 (در بهترین حالت تکثیر محصولات ) تا 1 ( عدم تکثیر محصولات) متغیر می باشد. پس در فرمول 3 اگر E برابر با 1 باشد، پرایمرها کارایی نداشته و محصولی تکثیر نشده است.

در مجموع می توان گفت ضرورت محاسبه میزان کارایی پرایمرها و یا میزان E در محاسبه دقیق میزان fold change برای نتایج ریل تایم می باشد.

برای محاسبه میزان کارایی پرایمرها و یا میزان E از دو روش می توان استفاده نمود.

1. استفاده از رقت های متوالی در واکنش ریل تایم و ترسیم منحنی استاندارد و محاسبه شیب خط
2. استفاده از نرم افزار linregPCR

روش اول نیازمند تهیه رقت های متوالی از نمونه ها می باشد بنابراین روش اول نیازمند صرف هزینه های بیشتر می باشد اما در روش دوم با استفاده از نرم افزار linregPCR می توان نتایج ریل تایم حاصل از نمونه های اصلی را مورد بررسی قرار داد و به این طریق میزان کارایی پرایمرها و میزان E را محاسبه نمود.

آشنایی با نرم افزار LinRegPCR

نرم افزار LinRegPCR یک نرم افزار برای بررسی داده های ریل تایم به منظور محاسبه کارایی پرایمرها و PCR ( E یا PCR Efficiency) می باشد. این نرم افزار داده های ریل تایم را بررسی نموده و با اصلاح baseline در همه نمونه ها و تشخیص ناحیه window-of-linearity ( ناحیه W-o-L)برای هر نمونه، بوسیله رگرسیون خطی و تخمین شیب (slope) خط رگرسیون برای هر نمونه، کارایی پرایمرها و PCR ( E یا PCR Efficiency) را محاسبه می نماید.

قبلا ادامه آموزش، آشنایی با چند اصطلاح:

Baseline: میزان فلورسنت سنجش شده قبل از اینکه محصولی تکثیر شود. این فلورسنت از cDNA، پرایمرها و رنگ های فلورسنت آزاد در محیط واکنش نشر می یابد (شکل 1).

E یا PCR Efficiency: کارایی PCR (یا ریل تایم) که بیان 2 تا 1 متغیر می باشد و به معنی میزان افزایش محصولات در هر سیکل از واکنش PCR می باشد. در بهترین شرایط میزان آن برابر 2 می باشد که در این حالت کارایی پرایمرها برابر با 100درصد می باشد، اما در صورت عدم تکثیر محصول میزان E برابر با 1 خواهد بود که در این حالت کارایی پرایمرها برابر با صفر درصد می باشد.

فاز لگاریتمی و یا فاز نمایی (Exponential or log-linear phase): مر حله ای در واکنش PCR که در آن میزان محصولات به صورت نمایی افزایش خواهد یافت. در این مرحله میزان فلورسنت نشر شده از Baseline فراتر خواهد رفت (شکل 1). محاسبه کارایی PCR و پرایمرها در این مرحله محاسبه خواهد شد.

شکل 1: Baseline و مرحله فاز لگاریتمی ( یا فاز نمایی) در واکنش ریل تایم

Raw data: داداه های حاصل از نور فلورسنت سنجش شده برای هر نمونه در هر سیکل از ریل تایم.

RDML: نوعی فایل که داده ها ونتایج حاصل از ریل تایم (به عنوان مثال Raw data ) را می توان به فرمت آن ذخیره نمود.

Sample: به هر چاهک (ویال) در واکنش ریل تایم یک Sample می گویند.

ناحیه Window-of-Linearity (یا ناحیه W-o-L): محدوده ای از فاز نمایی (یا لگاریتمی) واکنش ریل تایم که از داده های آن محدوده برای محاسبه میزان کارایی پرایمرها و PCR استفاده خواهد شد. این محدوده به صورت خودکار تعیین می شود و معمولا شامل داده های 4 سیکل برای هر نمونه در فاز لگاریتمی می باشد. البته این محدوده را می توان به صورت دستی نیز تعیین نمود. توضیحات لازم در قسمت مربوطه ارائه خواهد شد.

تئوری محاسبه کارایی پرایمرها در واکنش ریل تایم بوسیله نرم افزار LinRegPCR

فرمول 4 نحوه محاسبه میزان محصول تکثیر شده در ریل تایم را در هر سیکل نشان می دهد.

فرمول 4: نحوه محاسبه میزان محصول تکثیر شده در هر سیکل.

در فرمول 4: N_C برابر با میزان محصول در سیکل مورد نظر (سیکل C)

N₀: برابر با غلظت الکو در ابتدای واکنش

E: برابر با میزان کارایی PCR

C: برابر با سیکل مورد نظر می باشد.

اگر از دو طرف فرمول 4 لگاریتم گرفته شود فرمول 5 به دست می آید.

فرمول5.

در فرمول فوق log(E)، لگاریتم کارایی واکنش ریل تایم می باشد. نرم افزار LinRegPCR داده های raw data ریل تایم را بررسی نموده و با اصلاح baseline در همه نمونه ها و تشخیص ناحیه window-of-linearity برای هر نمونه، بوسیله رگرسیون خطی و تخمین شیب (slope) خط رگرسیون برای هر نمونه، کارایی پرایمرها ( E یا PCR Efficiency) را محاسبه می نماید (شکل 2).

شکل 2: نحوه محاسبه کارایی پرایمرها و  PCR Efficiency بوسیله نرم افزار linregPCR.

مراحل محاسبه کارایی پرایمرها و  (PCR efficiency) بوسیله نرم افزار linregPCR.

به صورت کلی تعیین کارایی ریل تایم بوسیله نرم افزار linregPCR شامل مراحل زیر می باشد.

1. خروجی گرفتن از داده های RAW DATA در ریل تایم، ویرایش داده های و وارد نمودن داده ها در نرم افزار linregPCR.
2. اصلاح baselines داده های ورودی، تعیین ناحیه W-o-L و محاسبه کارایی PCR و پرایمرها توسط نرم افزار linregPCR.
3. گروه بندی نمونه های وارد شده برحسب نوع پرایمر و یا بافت.
4. بررسی کیفیت داده ها برای نمونه های مورد بررسی، که این قسمت شامل مراحل زیر می باشد:

-تصحیح نمودن baseline برای نمونه ها

-تصحیح نمودن ناحیه W-o-L برای گروه های تعریف شده در قسمت 3 و یا هر نمونه مجزا

5. محاسبه میانگین کارایی PCR برای گروه پرایمرها.

6. ذخیره نمودن نتایج.

پایان بخش مقدماتی

در بخش های فوق، توضیحات کاملی را در مورد مفاهیم کارایی PCR و پرایمرها ارائه نمودیم، سپس نرم افزار linregPCR را به صورت مقدماتی مورد بررسی قرار دادیم. فایل آموزشی پیشرفته ” آموزش محاسبه کارایی PCR و پرایمرها ( E یا PCR Efficiency) در ریل تایم با استفاده از نرم افزار LinRegPCR” شامل آموزش کامل و تصویری نحوه دریافت داده های ریل تایم، تصحیح فرمت داده ها، وارد نمودن داده ها در نرم افزار LinRegPCR، محاسبه کارایی PCR و پرایمرها، و بررسی کیفیت داده ها با استفاده از نرم افزار LinRegPCR در 100 صفحه می باشد. شما می توانید لیست کامل آموزش های فایل پیشرفته را در فهرست ارائه شده در ابتدای همین آموزش مشاهده نمایید.

برای تهیه آموزش پیشرفته آموزش محاسبه کارایی PCR و پرایمرها برای ریل تایم می توانید از لینک زیر اقدام نمایید.

https://pishgam-bio.ir/%d9%81%d8%b1%d9%88%d8%b4%da%af%d8%a7%d9%87