یکی از روش های تنظیم بیان ژن ها توسط میکروارناها اتصال به ناحیه 3 پریم UTR ترانسکریپ (mRNA) ژنها می باشد. با اتصال میکروارناها به این ناحیه در صورتی که اتصال با تعداد بازهای بالایی رخ بدهد ترانسکریپت ژن هدف تخریب می گردد. اما در صورتی که تعداد باز های جفا شده بین میکروارنا و ژن هدف کم باشد، اتصال میکروارنا به ژن هدف می تواند سبب جلوگیری و یا کاهش ترجمه ترانسکریپ ها و تولید پروتئین شود.

آموزش آزمون دوگانه لوسیفراز (dual luciferase assay) برای تعیین میانکنش و اتصال میکروارناها به ناحیه 3 پریم UTR ترانسکریپ ژن های هدف می باشد.

اصول آموزش آزمون دوگانه لوسیفراز (dual luciferase assay) برای بررسی میانکنش میکروارناها با ژن های هدف

به منظور بررسی میانکنش مستقیم بین میکروRNAها و ژن‌های هدف، بخش 3utr ژن‌های هدف در وکتور psiCHECK-2 و بعد از یک ژن لوسیفراز کلون می گردد. جهت کلون نمودن نواحی 3utr باید از آنزیم‌های Xho I و Not I استفاده نمود. از آنجایی که بخش 3utr ژن‌های هدف بعد از ژن لوسیفراز کلون شده است بنابراین بخش 3utr ژن‌های هدف به عنوان 3utr ژن‌ لوسیفراز مورد استفاده قرار می گیرد.

  

به دلیل این که توالی 3UTR ژن هدف بعد از یک ژن لوسیفراز کلون می‌گردد، بنابراین درصورتی که یک میکروRNA با توالی 3UTR میانکنش دهد، این میانکنش سبب کاهش سطح ترجمه ژن لوسیفراز می‌گردد. و کاهش ترجمه ژن لوسیفراز سبب کاهش نور تولید شده توسط ژن لوسیفراز می شود. بنابراین با بررسی تغییر میزان نور منتشر شده می توان، اثر میکروارنا برروی ژن هدف در محله سنتز پروتئین را مورد بررسی قرار داد.

  

اما در صورتی که بین میکروارنا با ناحیه 3UTR ژن هدف میانکنش ندهد بنابراین تغییری در میزان نور منتشر شده توسط ژن لوسیفراز ایجاد نمی شود.

کاربرد وکتور psiCHECK-2در آزمون دوگانه لوسیفراز

وکتور psiCHECK-2یک وکتور بیانی از شرکت Gen script می‌باشد که برای کلون نمودن قسمت 3UTR ژن‌ها و بررسی میانکنش آن‌ها با میکروRNAها به‌وسیله واکنش لوسیفراز طراحی‌شده است همچنین دارای جایگاه برش آنزیم‌های Xho I Not I ، جهت کلون قسمت 3UTR ژن‌ها می‌باشد. این وکتور دارای مارکر آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین برای سلول‌های پروکاریوتی است.

در این وکتور توالی 3UTR بعد از یک ژن لوسیفراز کلون می‌گردد، بنابراین درصورتی که یک میکروRNA با توالی 3UTR میانکنش دهد، این میانکنش سبب کاهش سطح ترجمه ژن لوسیفراز می‌گردد.

  

شکل نقشه وکتور psiCHECK-2 به صورت فوق است

وکتور psiCHECK-2 علاوه بر ژن لوسیفرازی که ناحیه 3پریم utr ژن هدف بعد از آن کلون می شود دارای یک ژن لوسیفراز دوم نیز می باشد که هیچ توالی ای نباید بعد از آن کلون شود. علت وجود ژن لوسیفراز دوم، نرمال نمودن داده های حاصل از ژن لوسیفراز اول می باشد. در واقع میزان نور سنجش شده از ژن لوسیفراز دوم باید در همه تیمارها یکسان باشد. برای نرمال نمودن داده های ژن لوسیفراز اول با ژن لوسیفراز دوم باید داده های ژن اول را بر داده های ژن دوم تقسیم نمود.

به دلیل وجود دو ژن لوسیفراز به این تکنیک “آزمون دوگانه لوسیفراز” گفته می شود.

انواع ترانسفکشن هم‌زمان در رده سلولی برای آزمون دوگانه لوسیفراز

می توان سه نوع ترانسفکشن هم زمان برای بررسی میانکنش مستقیم میکروRNAهای منتخب با ژن‌های هدف در سلول‌ها انجام داد:

1. ترانسفکشن هم‌زمان سلول‌ها با سازه افزایش بیان دهنده میکروRNA و وکتور psicheck-II
2. ترانسفکشن هم‌زمان سلول‌ها با وکتور Mock و وکتور psicheck-II به عنوان کنترل. وکتور Mock فاقد توالی افزایش بیان میکروارناها می باشد و بنابراین به عنوان کنترل استفاده می شود.
3. ترانسفکشن هم‌زمان سلول‌ها با سازه افزایش بیان دهنده میکروRNA و وکتور psicheck-IIای که دارای توالی فاقد جایگاه شناسایی برای میکروRNA مورد بررسی می‌باشد. در این نوع تیمار میزان نور منتشر شده نباشد با کنترل Mock تغییری نشان دهد.

پروتوکل آزمون دوگاه لوسیفراز (dual luciferase assay)

برای سنجش میزان فعالیت لوسیفراز،ابتدا سلول‌های هر خانه را با 30 میکرولیتر از بافر PLB موجود در کیت لیز می‌شوند. سپس 20 میکرولیتر از این لیز سلولی را در لوله های مخصوص ریخته و با خواندن میزان نشر نور توسط دستگاه از عدم بیان لوسیفراز مطمئن می‌شویم. سپس 2 میکرولیتر از بافر LARII که حاوی سوبسترای لوسیفرین است، اضافه می‌کنیم و به سرعت نشر نور اندازه‌گیری می‌شود. در مرحله بعد به سرعت به لوله فوق 2 میکرولیتر بافر stop&glow که حاوی سوبسترای کوئنترازین است، اضافه می‌کنیم و به سرعت نشر نور اندازه‌گیری می‌شود. مراحل انجام کار به‌صورت شماتیک در شکل زیر آمده است.

  

شکل فوق: مراحل کار و پروتوکل  آزمون لوسیفراز دوگانه (dual luciferase assay)

سپس باید داده های خوانش دوم را بر داده های خوانش اول تقسیم نمود تا داده های نرمال شده حاصل شود. سپس داده های نرمال شده بین گروه های تیمار مقایسه شود. در صورت کاهش میانگین داده های نرمال شده در سلول های تیمار شده با میکروارنا نسبت به میانگین داده های نرمال شده در سلول های تیمار نشده کمتر باشد می توان نتیجه گرفت که میکروانا با میانکنش با ناحیه 3 پریم utr ژن هدف، این ژن دا در مرحله ترجمه و سنتز پروتئین تنظیم می نماید.