مرحله اول در بررسی کیفیت داده ها بررسی Ct کنترل های منفی (NTC) برای همه ژن ها می باشد.

میزان Ct تعیین شده برای نمونه های کنترل منفی باید بالای 38 باشد و یا برای نمونه های کنترل منفی Ctای تعیین نشده باشد. همچنین میزان Ct نمونه های کنترل منفی باید با Ct نمونه های RT+ بیش از 3 سیکل فاصله داشته باشد. به عنوان مثال اگر میزان Ct برای نمونه های کنترل منفی برابر 38 باشد حداکثر Ct مجاز برای نمونه های RT+ برابر 35 می باشد. پس در صورتی که میزان Ct برای نمونه های کنترل منفی از 38 کمتر باشد اما میزان Ct برای نمونه های RT+ به میزان حداقل 3 سیکل از Ct نمونه کنترل منفی کمتر باشد می توان داده ها را قابل قبول دانست ( البته در آزمایشگاه های پیشرفته اگر Ct کنترل منفی از 38 کمتر باشند نتایج را قابل قبول نمی دانند اما به دلیل اینکه قیمت مواد ریل تایم گران می باشد و شرایط تکرار آزمایش برای همه میسر نیست مجبور هستیم مرزهای قابل قبول بودن و غیر قابل بودن داده ها را کمی جابجا نماییم :D). در صورتی که داده های یک ژن دارای کیفیت مطلوب نباشد باید ریل تایم تکرار شود و آلودگی از محیط کار حذف شود.

 مرحله دوم بررسی کیفیت داده ها بررسی Ct کنترل های no-RT برای همه نمونه ها می باشد.

میزان Ct تعیین شده برای نمونه های no-RT باید بالای 36 باشد و یا برای این نمونه ها Ctای تعیین نشده باشد. همچنین میزان Ct نمونه های کنترل no-RT نیز (همانند Ct نمونه های کنترل منفی) باید با Ct نمونه های RT+ بیش از 3 سیکل فاصله داشته باشد. Ct پایین تر از 36 در نمونه های no-RT بیانگر آلوده بودن نمونه ها به DNA ژنومی می باشد. در صورتی که قادر به حذف آلودگی DNA ژنومی از نمونه های خود نیستید، باید پرایمرهای خود را به صورتی طراحی نمایید که مختص توالی mRNA باشد و به توالی DNA متصل نشود. آموزش نحوه طراحی پرایمر به صورت اختصاصی برای توالی mRNA را می توانید از لینک زیر نهیه نمایید.

https://pishgam-bio.ir/product/%D8%A2%D9%85%D9%88%D8%B2%D8%B4-%D8%AA%D8%AE%D8%B5%D8%B5%DB%8C-%D8%B7%D8%B1%D8%A7%D8%AD%DB%8C-%D9%BE%D8%B1%D8%A7%DB%8C%D9%85%D8%B1%D9%87%D8%A7%DB%8C-%D8%B1%DB%8C%D9%84-%D8%AA%D8%A7%DB%8C%D9%85/

مرحله سوم: بررسی کیفیت داده های ریل تایم، بررسی داده های Ct برای تکرارهای ریل تایم هر نمونه (triplicateها) می باشد.

در آزمایش های زیستی همیشه احتمال خطای سمپلینگ وجود دارد برای همین هر نمونه را سه یا دو بار تکرار می نماییم تا در صورت وجود خطای سمپلینگ از آن مطلع شویم. در این مرحله برای همه نمونه ها و ژن ها میزان Ct هر سه تکرار ریل تایم را بررسی می نماییم برای همه تکرارها باید میزان Ct در یک محدوده ی یکسان قرار گرفته باشد و Ctها باید بسیار به هم شبیه باشند.

مرحله چهارم در بررسی کیفیت داده های ریل تایم بررسی میزان Ct ژن رفرنس برای هر نمونه می باشد.

در بسیاری از آزمایشگاه های پیشرفته Ct بالای 25 را برای ژن کنترل داخلی قابل قبول نمی دانند، اما به دلیل اینکه بسیاری از افراد در تکرار ریل تایم محدودیت دارند حد استانه رو بالاتر می آوریم و می گوییم که Ct کمتر از 30 (خیلی با ارفاق 31) برای ژن رفرنس قابل قبول می باشد. اما باید توجه نمود اگر میزان Ct برای ژن رفرنس از 24 بیشتر باشد در صورتی که بیان ژن هدف در نمونه مورد بررسی پایین باشد، ممکن Ct برای ژن هدف تشخیص داده نشود و به عبارت دیگر نمونه به Ct نرسد.

مرحله پنجم در بررسی کیفیت داده های ریل تایم بررسی میزان Ct برای هر نمونه می باشد.

در برخی از موارد حتی Ct بالای 34 را برای نمونه ها قابل قبول نمی دانند، اما به دلیل اینکه بسیاری در تکرار ریل تایم محدودیت دارند حد استانه رو بالاتر می بریم و می گوییم که Ct بالای 38 را برای نمونه ها قابل قبول نمی باشد. مخصوصا زمانی که کنترل های NTC و no-RT دارای Ct باشند.

در یک صورت می توان Ct بالای 38 را برای ژن مورد بررسی در نمونه ها مورد قبول دانست که نمونه ها دارای شرایط زیر باشند:

1. Ct ژن کنترل داخلی از 25 کمتر باشد (برابر 24 و یا کمتر از آن). البته میزان ایده آل حد آستانه کمتر از 21 می باشد.
2. از یک نمونه که ژن مورد نظر در آن بیان دارد به عنوان کنترل مثبت استفاده شود و Ct نمونه کنترل مثبت از 38 کمتر باشد.

بنابراین در صورتی که بیان یک ژن را در دو (یا چند) گروه بررسی می نمایید و Ct نمونه ها در گروه  اول بیشتر از 38 اما در گروه دیگر کمتر از 38 می باشد. در صورتی Ct گروه اول قابل قبول می باشد که Ct ژن کنترل داخلی در نمونه های گروه اول از 24 کمتر باشد. این نتایج نشان می دهد که ژن مورد بررسی در گروه اول فاقد بیان می باشد.

با استفاده از نرم افزار GenEx می توان کیفیت همه داده های را به صورت خودکار بررسی نمود و داده های مخدوش را مشخص و اصلاح نمود.