آشنایی با روش hrm برای تعیین ژنوتیپ و جهش ها (پلیمورفیسم یا SNP)

تکنیک hrm (High Resolution Melting) یک روش جدید برای شناسایی جهش ها ( پلی مورفیسم ها) می باشد. به عنوان در نظر داریم تمامی جهش های موجود در اگزون شماره 2 ژن asd84 را در 400 فرد مبتلا به سرطان ریه و 400 فرد سالم بررسی نماییم تا مشخص شود کدام جهش ها در افراد مبتلا به سرطان ریه فراوانی بیشتری دارد. در بررسی ما میخواهیم تمامی جهش ها ( که شامل جهش های شناخته شده و جهش های جدید ناشناخته می باشد) را مورد بررسی قرار دهیم، برای این هدف باید تمامی نمونه ها توالی یابی گردند. اما توالی یابی نمونه ها دارای معایبی می باشد:

• هزینه بسیار بالا برای توالی یابی تمام افراد در تکنیک توالی یابی
• بروز خطاها در حین توالی یابی که باعث می گردد هر نمونه دو بار مورد توالی یابی قرار بگیرد

برای حل مشکلات فوق از تکنیک hrm استفاده می کنیم

در روش hrm ابتدا ما افراد را بر اساس ژنوتیپتشان دسته بندی می کنیم. یعنی افرادی که دارای ژنوتیپ یکسان می باشند را در یک گروه قرار می دهیم.

پس امکان دارد 800 فرد مورد بررسی بر اساس شبیه بودن توالی اگزون مورد بررسی در چندین گروه دسته بندی شوند که تعداد گروه ها به تعداد جهش های موجود در توالی مورد بررسی بستگی دارد.

هر جهش به تنهایی می تواند دارای 3 گروه باشد که شامل گروه هموزیگوت برای الل فاقد جهش، گروه هموزیگوت برای الل جهش یافته و گروه هتروزیگوت می باشد. حال اگر ما در توالی خود 2 پلیمورفیسم داشته باشیم بنابراین تعداد گروه ها حداکثر برابر 3X3 می باشد. اما در عمل تعداد گروه ها کمتر از میزان مورد انتظار می باشد، به دلیل اینکه برخی از جهش ها هر سه گروه را دارا نمی باشند.

در صورتی که بیش از یک جهش را بررسی نماییم به هر یک از گروه ها یک هاپلوتایپ می گوییم.

بعد از تعیین اینکه هر فرد در چه گروهی قرار می گیرد از هر گروه(هاپلوتایپ) چند فرد را توالی یابی می نماییم تا توالی ژنومی افراد ( و تمام گروه، چون ژنوم همه افراد یه گروه شبیه هم می باشد) مشخص گردد. پس به وسیله این تکنیک نیازی به توالی یابی همه افراد نمی باشد.

از تکنیک های مشابه به HRM می توان به روش SSCP-PCR اشاره کرد. اما روش HRM از حساسیت بیستری برخوردار می باشد.

کاربرد روش HRMA برای شناساسی ژنوتیپ و جهش ها (پلیمورفیسم یا SNP)

• شناسایی وجود جهش ها در توالی مورد نظر نسبت به توالی مرجع
• شناسایی جهش های جدید در توالی مورد
• شناسایی نقاط متیله در توالی مورد نظر نسبت به توالی مرجع
• گروه بندی افراد بر حسب ژنوتیپ یک توالی مورد نظر
• تعیین کلاد افراد و ترسیم درخت های فیلوژنتیکی و خوشه بندی جمعیت های مختلف

اصول تکنیک HRMA برای شناساسی ژنوتیپ و جهش ها (پلیمورفیسم یا SNP)

در تکنیک hrm تفاوت بین ژنوتیپ های مختلف از طریق تفاوت در منحنی ذوب مشخص می گردد. به این صورت که حتی یک تغییر در توالی ژن ها (جهش) می تواند در Tm ( دمایی که در آن 50 درصد توالی ها به صورت تک رشته ای در می آیند) تاثیر بگذارد و سبب تغییر منحنی ذوب آن قطعه گردد. شکل پایین سمت چپ

به وسیله تکنیک hrm می تواند ژنوتیپ های مختلف (و هاپلوتایپ های مختلف) را از هم تفکیک نمود. شکل پایین سمت راست

برای تعیین منحنی ذوب یک قطعه باید از دستگاه real time و رنگ های فلورسنت مانند eva green استفاده نمود.

برای تکنیک hrm کیت هایی برای افزایش حساسیت تکنیک ارائه میگردد. اما می توان رنگ های فلورسنت مانند eva green نیز استفاده نمود.

رنگ های فلورسنت eva green نسبت به سایر رنگ ها مانند سایبرگرین دارای حساسیت بیشتری می باشد.

برای آنالیز منحنی ذوب نرم افزار اختصاصی هر دستگاه real time طراحی شده است که نحوه کار با این نرم افزار ها در پست های بعدی ارائه می گردد.

آموزش اصول طراحی پرایمر برای تکنیک hrm

طول قطعه طراحی شده باید کمتر از 400 جفت باز باشد

بهتر است پرایمرها برروی توالی DNA طراحی گردند و از DNA به عنوان الگو در تکثیر استفاده گردد.

نمونه هایی که در تکنیک hrm مورد بررسی قرار می گیردند باید دارای ct تقریبا مشابه باشد و کیفیت DNA باید به صورتی باشد که ct نمونه ها کمتر از 25 باشد

تغییراتی که جهش برروی tm میگذارد در شکل زیر قابل مشاهده است. جهش A به T به دلیل اینکه تغییرات کمتری در دمای tm ایجاد میکنند برای بررسی سخت تر می باشند.