آموزش روش تر سیم منحني استاندارد جهت تعیین میزان مطلق ژن ها در تکنیک Real time PCR

یکی از روش های آنالیز داده های ریل تایم، ترسیم منحنی استاندارد جهت سنجش میزان مطلق ژن هدف در نمونه ها می باشد. در اين روش از یک نمونه RNA يا DNA با غلظت مشخص براي رسم منحني استاندارد استفاده مي شود. ابتدا غلظت RNA يا DNA استاندارد با روش اسپکتروفوتومتر تعيين مي شود و سپس با استفاده از وزن مولکولی توالی RNA يا DNA می توان تعداد نسخه های RNA يا DNA را در نمونه استاندارد تعیین نمود. در مرحله بعد از این نمونه استاندارد چند سری رقت متوالی تهیه می گردد که تعداد نسخه های ژن هدف و یا میزان آن به نانوگرم در هر رقت مشخص می باشد. سپس برای این نمونه ها ریل تایم گذاشته می شود. البته در این روش علاوه بر نمونه های حاصل از رقت های متوالی، نمونه های مورد بررسی (که تعداد نسخه ژن هدف باید در آن ها تعیین گردد) نیز با ریل تایم بررسی و میزان Ct برای همه نمونه ها مشخص خواهد شد. در مرحله بعد يک نمودار استاندارد از نمونه هاي رقيق شده ترسیم می گردد بدين صورت که محور X  ميزان رقيق سازي يا تعداد کپي ژن  هدف و محور Y ميزان Ct هر نمونه می باشد، در ادامه با مقایسه Ct حاصل برای نمونه هدف با نمودار استاندارد می توان ميزان کپي و يا غلظت ژن هدف را در آن نمونه محاسبه نمود.

آموزش روش مقایسه نسبی بیان ژن ها در تکنیک Real time PCR

در این روش بیان یک یا چند ژن هدف بین دو یا چند گروه (به عنوان مثال تومری و نرمال) مقایسه می گردد. در این روش معمولا بیان ژن هدف در همه گروه ها نسبت به یک گروه مرجع محاسبه می گردد. در روش ریل تایم هنگامی که میزان بیان یک ژن را در چند گروه مقایسه می نماییم بهترین راه گزارش میزان تغییرات آن ژن در یک نمونه نسبت به نمونه دیگر fold change می باشد. مفهوم fold change همان “چند برابر” می باشد، به عبارت بهتر بیان ژن مورد نظر در نمونه های گروه اول  (به عنوان مثال نمونه های سرطانی) نسبت به نمونه های گروه دوم (به عنوان مثال نمونه های نرمال) چند برابر افزایش و یا کاهش یافته است؟ این جمله به این مفهوم است که اگر بیان ژن هدف را در گروه اول برابر 1 در نظر بگیریم، بیان آن در گروه دوم برابر چه میزانی خواهد بود؟

براي حذف نوسانات مقادير RNA وارد شده در واکنش و خطاهای دستگاه ها و افراد در این روش از ژن های رفرنس به عنوان کنترل استفاده می شود. ژن های رفرنس بايد در همه بافت ها بيان ثابت داشته باشند. بدين منظور از ژن هايي تحت عنوان Housekeeping genes مانند b-actin و GAPDH استفاده می شود. بيان اين ژن ها در همه نمونه ها وبافت ها ثابت می باشد و از مقايسه بیان ژن هدف با ژن کنترل داخلی می توان کاهش يا افزايش بيان ژن هدف در نمونه ها را مشخص نمود.