همه آزمایش های زیستی شامل دو نوع تکرار اصلی می باشند:

1. تکرار بیولوژیک
2. تکرار تکنیکال

آزمایش ریل تایم علاوه بر دو تکرار فوق دارای یک تکرار اختصاصی به نام تکرار qPCR و یا ریل تایم نیز می باشد.

منظور از تکرار بیولوژیک در بررسی بیان ژن ها به وسیله ریل تایم (real time pcr) چیست؟

تکرار بیولوژیک از واژه بیولوژی به معنی زیست شناسی گرفته شده است، علم زیست شناسی نیز علم مطالعه موجودات زنده می باشد بنابراین در آزمایش ها به نمونه های زنده یا نمونه هایی که قبلا زنده بودند تکرار بیولوژِک گفته می شود. به عنوان مثال در یک آزمایش که بیان یک ژن هدف در 50 فرد بیمار و 50 فرد سالم مورد بررسی قرار می گیرد، هر گروه سالم و نرمال دارای 50 تکرار بیولوژیک می باشد. در آزمایشی که اثر یک دارو بر روی 5 رده سلولی بررسی می گردد، 5 تکرار بیولوژیک وجود دارد. اگر نمونه خون و یا یافت از 40 نفر تهیه شود این آزمایش نیز دارای 40 تکرار بیولوژیک می باشد.

 شکل زیر تکرارهای یک آزمایش را با مثال توضیح می دهد.

در آزمایش طراحی شده در شکل فوق، دو نمونه از یک رده سلولی به عنوان گروه اول با ویتامین D تیمار شده اند و دو نمونه نیز در گروه دوم به عنوان کنترل ( تیمار نشده) در نظر گرفته شده است. بنابراین گروه کنترل و شاهد دارای دو تکرار بیولوژیک می باشند.

منظور از تکرار تکنیکال در بررسی بیان ژن ها به وسیله ریل تایم (real time pcr) چیست؟

هنگامی که  نمونه ها بیان یک ژن هدف باید سنجیده شود باید از هر نمونه بیولوژیک باید RNA استخراج شود و سپس سنتز cDNA انجام گیرد و در مرحله بعد بوسیله ریل تایم تغییر بیان ژن هدف بررسی شود. سوالی که پیش می آید این است که آیا فرایند استخراج RNA، سنتز cDNA و ریل تایم به درستی انجام می گیرد؟ برای پاسخ به این سوال باید پس از انجام مراحل فوق، یک بار دیگر نیز از نمونه های بیولوژیک استخراج RNA و سنتز cDNA انجام پذیرد و سپس بر روی cDNA های جدید ریل تام انجام شود و نتایج جدید با نتایج قدیم برای هر نمونه بررسی شود. در صورتی که نتایج هر دو تکرار مشابه باشد می توان گفت که فرایند استخراج RNA، سنتز cDNA و ریل تایم به درستی انجام شده است. در واقع در این تکرار، تکنیک و روش کار مورد بررسی قرار گرفته است به همین دلیل به این تکرار، تکرار تکنیکال گفته می شود. بنابراین تکرار تکنیکال در سطح استخراج RNA، سنتز cDNA و واکنش ریل تایم می باشد و تکرار بیولوژیک در سطح نمونه های زنده می باشد. در شکل فوق از هر نمونه بیولوژیک دو بار به صورت جداگانه استخراج RNA و سنتز cDNA انجام گرفته است برای همین آزمایش فوق دارای 2 تکرار تکنیکال می باشد. از آنجایی که امکان دارد پس زمینه (back graound) ژنتیکی نمونه های زنده با یکدیگر متفاوت باشد ممکن است نتایج حاصل از بررسی بیان ژن هدف در بین تکرارهای بیولوژیک مقداری متفاوت باشد اما تمام تکرارهای تکنیکال برای یک نمونه زیستی باید تا حد زیادی مشابه باشند. توجه نمایید در آزمایش هایی مانند شکل فوق که در آن چند نمونه با پس زمینه ژنتیکی یکسان به عنوان تکرار بیولوژیک در نظر گرفت می شوند، در صورتی که نتایج تکرارهای بیولوژیک با یکدیگر تفاوت داشته باشند دلیل آن می تواند عدم بهینه بودن آزمایش (مانند عدم یکسان بودن نتیجه تیمارها) باشد و حتی در صورت مشاهده اختلاف زیاد بین تکرارهای بیولوژیک احتمال عدم تکرار پذیر بودن نتایج نیز وجود دارد. بنابراین یکی از دلایل وجود تکرارهای بیولوژیکی بررسی تکرار پذیری آزمایش می باشد.

در صورت مشاهده اختلاف نتایج در بین تکرارهای تکنیکال یک نمونه بیولوژیک، باید روند آزمایش بهینه سازی شود و در روش ریل تایم  باید مراحل استخراج RNA و سنتز cDNA بهینه گردند.

فرض نمایید که فرایند سنتز cDNA برای نمونه های بیولوژیک به درستی صورت گرفته باشد پس اکنون نوبت انجام واکنش ریل تایم می باشد. در انجام واکنش ریل تایم سمپلینگ نمونه ها بسیار مهم می باشد بنابراین در صورتی که یک فرد سمپلینگ نمونه ها را به درستی انجام ندهد، نتایج حاصله قابل اعتماد نمی باشد. پس در واکنش ریل تایم برای اطمینان از سمپلینگ درست، باید برای هر نمونه cDNA دو یا 3 واکنش در نظر گرفته شود. منظور از واکنش در این مرحله این است که واکنش ریل تایم برای هر نمونه  cDNA در 2 یا 3 ویال تکرار گردد که به این تکرارها، تکرارهای ریل تایم و یا qPCR گفته می شود که دقت سمپلینگ فرد را نشان می دهد. در روش ریل تایم نتایج به دست آمده برای تکرارهای ریل تایم باید یکسان باشد و در صورت مشاهده اختلاف نتایج در بین تکرارهای ریل تایم، باید در سمپلینگ نمونه ها توجه بیشتری نمود.