در حال حاضر RNAمداخله گر (RNAi) بهترین روش جهت بررسی عملکرد ژن ها در ژنتیک معکوس (Reverse genetics) می باشد. نتایج تحقیقات زیادی در این زمینه نشان می دهد که این روش بسیار اختصاصی عمل می کند و راه اندازی چنین سیستمی در قیاس با سایر سیستم های غیر فعال سازی ژنها ساده تر و ارزان تر است.
مهم ترین اجرای این مکانیسم عبارتند ازsiRNA ، DICER ، dsRNA و RISC می باشند.
نقش RNA دو رشته ای (dsRNA) در سیستم RNA مداخله گر (RNAi)
در سیستم RNA مداخله گر (RNAi) القا کننده اصلی خاموشی ژن هدف یک RNA دو رشته ای (dsRNA) می باشد که منابع اصلی آن عبارتند از:
1-نسخه برداری ژن های با توالی های معکوس و تولید mRNAهایی که سنس و آنتی سنس یکدیگرند و قابلیت جفت شدن با هم را دارا می باشند.
2- رونویسی RNA توسط آنزیم RNA dependent RNA polymerase (یا RdRp)
که اگر رونویسی از روی mRNA صورت گیرد رشته آنتی سنس siRNA نقش آغازگر را برای آنزیم بر عهده خواهد داشت اما اگر رونویسی از روی RNA ناقص (Aberrant RNA) که نتیجه شکستن mRNA در فرآیند PTGS است صورت گیرد نیازی به آغازگر وجود ندارد.
3-پلاسمید خارجی کدکننده shRNA
shRNA یک RNA دو رشته ای می باشد که به عنوان پیش ساز siRNAها مورد استفاده قرار می گیرد.
نقش siRNA در سیستم RNA مداخله گر (RNAi)
این القاگرهای RNAi به صورت RNA خطی و دورشته ای جفت شده بوده که به صورت مستقیم به سیتوپلاسم انتقال می یابند یا از محیط جذب سیتوپلاسم می شوند. dsRNA ها به وسیله دایسر جهت تولید siRNAها برش یافته و باعث خاموشی می شوند در آزمایشهایی چندین siRNA از نواحی متفاوت کدون ژن ایجاد شد که هر کدام از لحاظ خاموشی ژن کارکرد متفاوتی رو نشان دادند.
نقش آنزیم دایسر (Dicer ) در سیستم RNA مداخله گر (RNAi)
اعضای خانواده RNase III دارای تعدادی از نوکلئازها هستند که برای RNAهای دو رشته ای به صورت اختصاصی عمل می کنند نوکلئازها RNAهای دو رشته ای را برش می دهند و انتهای 5 فسفات و ۳ هیدروکسیل را از دو انتها به وجود می آورند که انتهای ۳ دارای ۲ یا ۳ نوکلوتید آویزان می باشد.
در سال 2011 آنزیم شبه RNaselII را از مگس سرکه جداسازی کردند که توانایی تولید قطعات ۲۲ نوکلوتید شبیه به محصولات تولید شده در RNAi را دارا بود این دانشمندان نشان دادند که این آنزیم برای شروع RNAi ضروری است.
به خاطر توانایی برش dsRNA به قطعات با اندازه کوچک و یکسان این آنزیم Dicer نامیده شد. که به صورت DCR مخفف می شود و محصول آن را small interfering RNA (siRNA)می نامند. این نوکلئاز در کرم ها، مگس ها، قارچ ها و گیاهان و پستان داران حفظ شده است. Dicer دارای چهار ناحیه می باشد، ناحيه هلیکازی با انتهای آمینی، ناحیه دو گانه RNaseIII، ناحيه متصل شونده به dsRNA و ناحیه PAZ می باشد
عمل برش دایسر به وسیله ناحیه دوگانه RNaseIII انجام می شود. معمولا دو واحد دایسر با ایجادچهار مرکز کاتالیتیک بر روی dsRNA عمل می کنند.
نقش آنزیم RNA – Induced silencing complex ) RISC) در سیستم RNA مداخله گر (RNAi)
کمپلکس القا کننده خاموشی یک ترکیب پیچیده است که با اتصال به siRNA به واسطه رشته آنتی سنس آن به سمت توالی مشابه بر روی mRNA هدایت می شود و با بخش نوکلئازی خودش منجر به تخریب mRNA هدف می گردد. این ترکیب ریبونوکلئوپروتئینی KDa500 وزن دارد. هنوز اجزا دقیق RISC به طور کامل شناسایی نشده اند اما برخی از اجزای آن شامل موارد ذیل است:
– پروتئین های متصل شونده به (RNA ( RNA binding proteins .
– هلیکاز که سبب باز شدن دو رشته siRNA از هم می شود.
– (RdRp ( RNA dependent RNA polymerase که به کمک آن RNA تک رشته ای، دو رشته ای
می شود. RdRP نقش بسیار مهمی در تکثیر سیگنال siRNA بازی می کند و اجازه گسترش آن را در سراسر بدن موجود می دهد. هم چنین RdRP ممكن است مسئول ادامه دادن PTGS و نگه داری سطح آن در غیاب
dsRNA باشد.
پروتئین های درون غشایی (Transmembrane proteins) : انتشار سیستمیک خاموشی ژن از یک سلول به سلول دیگر به خوبی در موجودات مختلف روشن شده است در این زمینه یک سری از پروتئین ها نقش دارند که احتمالا بخشی از RISC هستند و به عنوان کانال یا گیرنده جهت انتشار سیستمیک سیگنال –
های خاموشی که همان siRNA ها هستند عمل می کنند.
پروتئین های نوکلئازی که در هنگام اتصال به mRNA باعث تجزیه آن می شوند.
