siRNA ،شامل RNAهای دورشته‌ای به طول 18 الی 21 جفت بازی هستند که با قرار گرفتن در داخل کمپلکس پروتئینی به اسم RISC موجب خاموشی ژن ها پس از رونویسی ژن مربوطه می‌شوند. و به این طریق می توان عملکرد ژن هدف را مورد بررسی قرار داد. کاربرد siRNA تنها محدود به کشف عملکرد ژنها نمی شود بلکه بعنوان روشی نوین جهت خاموشی فعالیت بیش از حد ژن ها در درمان بیماری های مختلف نیز عمل نیز می نماید.
با وجود عملکرد مناسب siRNA در شناسایی عملکردهای ژنتیکی، برخی از محدودیت ها سبب کاهش کارایی این روش می گردند. محدودیت اول در روش RNAi طراحی یک توالی siRNA موثر است.
آیا توالی siRNA طراحی شده قادر است به صورت موثر بیان و فعالیت یک ژن را خاموش نماید؟ در ادامه اصولی را برای طراحی siRNA بیان می نماییم که می تواند کارایی این روش را تا حد زیادی افزایش دهد.
اصول طراحی siRNA در روش RNAi
معمولا طول قطعات 21 نوکلئوتید انتخاب می شود.
ناحیه هدف bp۱۰۰ – ۵۰ با کدونهای ابتدایی و انتهایی توالی cDNA فاصله داشته باشند.
طراحی siRNA نباید در نواحی اینترونی انجام شود.
مقدار نسبت G + C بین ۲۵-۳۰ ٪ باشد.
نواحی دارای تکرار و یا پیچیدگی کم هدف قرار نگیرند.
از انتخاب نواحی SNPخودداری شود.
ناحیه انتخاب شده با نواحی مشابه ژن دیگری همولوژی نداشته باشد.
ناحیه هدف ساختمان ثانویه نداشته باشد.
ناحیه هدف محل اتصال پروتئین نباشد.
اصول کلی طراحی الیگو نوکلئوتیدهای siRNA که بازدهی اثرsiRNA را می افزاید
A / u در انتهای 5 رشته antisense
حداقل پنج باقیمانده A / U در یک سوم انتهای 5 رشته
عدم وجود ناحیه با بیش از ۹ G / C
عدم وجود G در جایگاه ۱۳
عدم حضور G یا C در جایگاه ۱۹
وجود بیش از 3 باز A / u بین موقعیت ۱۳ و ۱۹ در توالی رشته sense
همچنین عدم تقارن siRNA به تشکیل RISC کمک می کند و توالی هدف با این خصوصیت فاقد ساختار ثانویه خواهد بود و سهولت دسترسی به توالی برای تشخیص توالی هدف باعث بهبود موفقیت RNAi می شود.
به صورت خلاصه توالی siRNA باید 50 تا 100 نوکلئوتید پایین تر از کدون آغازکر انتخاب شود و ژن مورد نظر تنها هدف خاموشی siRNA باشد. همچنین محتوی GC در siRNA باید 25 تا 30 درصد باشند و از طراحی siRNA بر روی نواحی دارای ساختار ثانویه باید خودداری شود.
در انتها این نکته را باید متذکر شده که به دلیل هزینه گزاف سنتز siRNA و عدم تكثیر آن درون سلول پستانداران از انتقال سازه هایی (وکتور یا پلاسمید) که توانایی تولید siRNA درون سلول را دارد استفاده میشود (روش shRNA).
