آشنایی با انواع نشانگر های ژنتیکی و مولکولی برای برررسی روابط فیلوژنی و ترسیم درخت فیلوژنتیکی

تعریف مارکر (نشانگر) : نشانگر ژنتیکی چیست

واژه نشانگر معمولاً برای لوکوس به کار می‏رود و نشانگر‏‏های ژنتیکی^[1] مکانهایی بر روی کروموزوم ها هستند که در انالیز و مطالعه ژنوم موجودات مورد استفاده قرا می‏گیرند (Staub and Serquen, 1996) .

آن چه منبع تنوع ژنتیکی می‏باشداختلاف بین توالی DNA و کروموزوم‏‏های دو فرد است، این اختلاف در توالی DNA را می‏توان  به وسیله روش‏های مختلفی می‏تواند مشخص نمود. وجود اختلاف در توالی نواحی کد کننده سبب بروز این اختلاف در بعضی خصوصیات فنوتیپی فرد می‏گرددد، برخی اختلافات فنوتیپی با چشم قابل رویت هستند که با بررسی آن‏‏ها می‏توان  به میزان تنوع پی برد، برخی اختلافات فنوتیپی نیازمند روش‏های پیچیده تری برای  مشخص نمودن ان ها می‏باشد، بعضی با بررسی پروتئین ها و انزیم ها از بافت های مختلف و  بعضی را با مطالعه کروموزوم ها می‏توان  آنالیز نمود. بعضی از اختلافات در توالی، در نقاطی از DNA می‏باشند که جزء نواحی کد کننده نمی‏باشند و فنوتیپ ظهور پیدا نمی‏کنند، این دسته از تغییرات را باید با آنالیز مستقیم DNA شناسایی نمود. بنابر این نشانگر های ژنتیکی خود به انواع مختلفی تقسیم می‏شوند از جمله: نشانگر های مورفولوژیکی، نشانگر های سیتولوژیکی و نشانگرهای مولکولی .

آشنایی با کاربرد نشانگر های مورفولوژیکی در بررسی روابط فیلوژنی بین گونه ها

برخی تفاوت ها در ردیف باز های DNA در ظاهر افراد (فنوتیپ) قابل تشخیص هستند. این تفاوت ها را می‏توان  بدون آگاهی از توالی DNA و از طریق وراثت مندلی مورد بررسی و مطالعه قرار داد. به عبارتی وراثت این گونه صفات را می‏توان  بدون نیاز به روش‏های بیوشیمیایی و مولکولی دنبال کرد (قره یاضی، 1375‏‏).

خصوصیات کیفی مهم میوه انار شامل شکل و اندازه مناسب میوه، رنگ پوست، رنگ دانه، میزان آب، قند و اسیدیته است که تفاوت زیادی بین ژنوتیپ ها برای این شاخص ها وجود دارد که عمدتا تحت تاثیر ژنتیک، شرایط منطقه و زمان و زمان برداشت قرار می‏گیرند(Ford- Lloyd and painting, 1996). به علاوه صفات مهم دیگری شامل نرمی دانگی، مقاومت به ترک خورده گی، مقاومت به آفات و امراض خصوصیات بازاررسانی و انبارداری میوه است از این میان مقاومت به ترک خورده گی شدیدا تحت تاثیر محیط می‏باشد(Mars et al 1999).

این نشانگر ها معایب و محدودیت های زیادی دارند . بسیاری از پارامتر ها غالبا تحت تاثیر محیط و سن موجود قرار می‏گیرند و صفتی که عرضه می‏شود ممکن است اساس و توضیح ژنتیکی نداشته باشد. گاهی برای مشاهده و ثبت آن‏ها باید منتظر ظهورشان ماند که برای گیاهان چند ساله بسیار مشکل است. در تحقیقات  عواملی مانند اپیستازی^[2] و پلیوتروپی^[3] هم می‏توانند روی بیان آن‏ها اثر بگذارند.  همچنین تعداد نشانگر های مورفولوژیکی محدود می‏باشدو آلل های آن‏ها به صورت غالب و مغلوب عمل می‏کنند و لذا تشخیص افراد هتروزیگوت از هموزیگوت امکان پذیر نیست. از سوی دیگر اغلب این نشانگر‏‏ها جهش یافته هستند و جمع آوری آن‏ها در یک لاین^[4] نه تنها باعث بروز صفات نامطلوب در گیاهان می‏شوند بلکه انجام چنین کاری دشوار، پرهزینه و وقت گیر است با این وجود به دلیل ساده و کم هزینه بودن و عدم نیاز به امکانات پیچیده و گران قیمت، هنوز هم محققین بسیاری از این نشانگر ها استفاده می‏کنند (Kumar, 1999).

توضیح نشانگر های (مارکرهای) سیتولوژیکی

اغلب منظور از مطالعه سیتوژنتیکی،  بررسی رفتار کروموزومها در میوز و بررسی پتانسیل ژنتیکی ارقام در تولید گامتهای کاهش نیافته، تعداد B کروموزوم، شناسایی ناهنجاریهای ژنتیکی، تلوسنتریک ها^[5]، ایزوکروموزوم ها^[6]، جا به جایی ها^[7] و الگوهای نوار بندی^[8]  می‏باشد(شیدایی، 1381). در بسیاری از موجودات زنده اعم از گیاه و جانور تفاوت هایی در گستره کروموزومی مشاهده می‏شود.

تعریف مارکر مولکولی چیست؟ منظور از نشانگر های مولکولی چیست

نشانگر های مولکولی شامل نشان گرهایی که پلی مورفیسم را در سطح پروتئین نشان می‏دهد و نشان گر هایی که پلی مورفیسم را در سطح DNA نشان می‏دهند( نشانگر های DNA )، می‏باشد.

نشان گر های DNA نیز به نوبه خود به دو گروه تکنیک های مبتنی بر هیبریداسیون (غیر مبتنی بر PCR) مثل چند شکلی طول قطعات حاصل از برش (RFLP) و تکنیک های مبتنی بر PCR مثل تکنیک ^[9]RAPD تقسیم می‏شوند.

ویژگی های یک مارکر (نشانگر) مولکولی مناسب برای بررسی تبارزایی ( روابط فیلوژنتیکی) چیست

یک نشانگر مولکولی مطلوب باید دارا ویژگی‏های زیر می‏باشد.

1- دارای وراثت مندلی باشد.

2- میزان پلی مورفیسم در آن بالا باشد: هر قدر تعداد آلل های قابل تشخیص در یک لوکوس بیشتر باشد ، بهتر است.

3- هم بارز بودن: قادر به تمایز افراد هتروزیگوت و هموزیگوت از هم باشد .

4 ژنوتیپ لوکوس تحت تاثیر لوکوس دیگر قرار نگیرد.

5- دارای تکرار پذیری^[10] بالا باشد .

6- در ژنوم پراکنده گی و فراوانی بالایی داشته باشد .

7- بیان آن مستقل از محیط باشد.

8- نماینده ای از کل ژنوم فرد باشند ( به غیر از زمانیکه نشانگر مختص به لوکوس خاص است).

9- خنثی: تمام آلل ها سازش یکسانی داشته باشند .

10- کم هزینه و سریع  و راحت باشد .

البته هیچ یک از نشانگرهای مولکولی همه این ویژگی‏ها را با هم ندارند . بعضی به دلیل هم باز بودن در اصلاح نژاد بکار می‏روند و بعضی به دلیل اینکه پلی مورفسیم بالایی دارند در مطالعات تنوع ژنتیکی کاربرد دارند . بعضی نیز به دلیل تکرار پذیر بودن نتایج رایج می‏باشند. لذا یک محقق بنابر اهداف و امکانات خود نشانگر مطلوب خود را انتخاب می‏کند (Ford- Lloyd and painting, 1996).

آشنایی با انواع مارکرهای مولکولی

نشانگر های مولکولی پروتئینی

دردهه 1950، نشانگرهاي مولكولي قابل مشاهده توسط الكتروفورز پروتئين‌هاي تحول شگرفي را ايجاد نمودند. برخی از تفاوت‌هاي موجود در توالي DNA بصورت پروتئين‌هايي با اندازه‌هاي مختلف نمايان مي‏شود كه با روش‌هاي مختلف بيوشيميايي قابل ثبت و مطالعه مي‌باشند. به اين نشانگرها، نشانگرهاي بيوشيميايي نيز گفته مي‏شود. در واقع اين نشانگر پلي‌مورفيسم را در سطح پروتئين نشان مي‌دهد. نشانگرهاي پروتئيني تغييرات را در سطح رديف و عمل ژن به صورت نشانگرهاي هم‌بارز نمايان مي‌كنند. از معايب اين نشانگرها محدود بودن آن‏هاست. همچنين اين نوع نشانگرها تحت تأثير تغييرات پس از ترجمه و تظاهر كمي برخي از آنزيم‌ها و پروتئين‌ها تحت تأثير مرحله رشد گياه قرار مي‌گيرد (نقوي. 1384).

از جمله این نشانگرها می‏توان  به پروتئین های ذخیره ای بذر^[11]، ایزوآنزیم ها^[12] و آلوآنزیم ها^[13] اشاره کرد که تعداد کم این نشانگر ها عامل محدود کننده آن ها به شمار می‏روند، علاوه بر این، محدودیت تنوع ژنتیکی نیز در آن‏ها وجود دارد. همچنین تحلیل فنوتیپ های الکتروفورزی آن‏ها پیچیده می‏باشدو برای بررسی آنزیم ها نیاز به نمونه های تازه می‏باشدکه در شرایط خاص جمع آوری شده و در سرمای مناسب حمل و نگه داری شوند (عطایی،1381).

نشانگرهاي مولكولي DNA

در حال حاضر بهترين راه بررسي تنوع زيستي و ژنتيكي در گونه ها، نژادها، جمعيت ها، لاين ها و سويه ها جانوري مهرداران و بي مهرگان و گیاهان بررسي نشانگرهای مولكولي DNA مي باشد

DNA هسته، كلروپلاست و يا ميتوكندري را می‏توان براي بررسي پلي‌مورفيسم استفاده نمود. نشانگرهاي مولكولي DNA فراوان ترین و آسان ترین نشانگرهای مولکولی می‏باشند و در هر موجود زنده‌اي می‏توان  از آن ها استفاده نمود . با كمك اين نشانگرها ايجاد نقشه‌هاي فيزيكي و ژنتيكي در موجودات زنده و همچنين شناسايي ژن‌ها كنترل شده صفات كمي و كيفي امكان‌پذير شده است (نقوي، 1384).

اين ماركرها نقش منعكس‌كننده اختلافات ارثي در توالي‌هاي DNA همولوگ بين افراد هستند. ماركر هاي مولكولي به دليل دارا بودن ويژگي هاي: تشخيص آسان افراد هتروزيگوت و هموزيگوت، نداشتن اپيستازي، توارث كامل، تشخيص در كل مراحل حيات، عدم محدوديت به ماده بيولوژي، دقت بسيار بالا و آسان بودن اندازه گيري آن‏ها بخوبي در جمعيتها قابل استفاده هستند. ماركرهاي RAPD، SSR، AFLP و ISSR از جمله مهمترين ماركرهاي مولكولي DNA هستند كه در بررسي ژنوم و در نهايت بررسي تنوع زيستي جانوران استفاده مي شوند. به كمك اين ماكرها، پارامترهاي مرتبط با تعيين ميزان تنوع از قبيل: فراواني آللها و ژنوتيپها، هتروزيگوسيته، تشابه ژنتيكي، فاصله ژنتيكي و … تعيين مي گردند.

به طول كلي تكنيك‌هاي بررسي پلي‌مورفيسم DNA را مي‌توان به دو گروه طبقه‌بندي كرد:

– تكنيك‌هاي مبتني بر هيبريداسيون^[14] (غيرمبتني بر PCR)

– تكنيك‌هاي مبتني بر PCR

[1] Genetic marker

[2] Epistasy

[3] Pleiotropy

[4] Line

[5] Telocentrics

[6] Isochromosomes

[7] Translocation

[8] Banding patterns

[9] Randomly Amplified Polymorphic DNA

[10] Reproducibility

[11] Seed storage proteins

[12] Isozymes

[13] Allozymes

[14] Hybridization