تاریخچه روش Restriction Fragment Length Polymorphism
نشانگرهاي [1]RFLP در سال 1980 توسط بوتستاتين براي مطالعه مستقيم DNA و يافتن نشانگرهاي ژنتيكي معرفي شدند (Karrp et al ., 1998). این تکنیک تنوع در اندازه قطعات حاصل از برش (هضم) با انزیم محدودکننده[2] را نشان میدهد. آنزيم‌هاي برش‌دهنده DNA، توالي خاصي را در سطح DNA شناسايي و برش مي‌دهند و لذا براساس وجود جهش در جايگاه‌هاي تشخيص و يا از بين رفتن جايگاه‌هاي شناسايي آنزيم قطعات متفاوتي بوجود مي‌آيد. در نتیجه جهش های نقطه ای و یا باز آرایی ( مانند حذف و اضافه) که سبب تفاوت در تعداد محل های برش آنزیمی و یا تغییر در اندازه قطعات میشود منجر به مشاهده پلی مورفیسم در ساختار DNA میگردد.
اصول روش RFLP
در این روش بعد از هضم کردن قطعات DNA با آنزیم های محدودکننده، قطعات حاصل را بوسیله ژل پلی اکریل آمید از یکدیگر جداکرده وسپس از روش لکه گذاری ساترن[3] و هیبریداسیون برای آشکار سازی قطعات استفاده میشود . کاوشگر های مورد استفاده در هیبریداسیون میتوانند از نوع رادیو اکتیو و یا غیر رادیواکتیو باشند .
برای بررسی بهتر تنوع میتوان از تلفیق ای ن روش با روشهای مبتنی بر PCR مثل روش Inter spacer RFLP براي ناحيه ژنهاي rDNA 28s – 18s استفاده نمود که این روش در ارقام انار کارایی موثری را ارائه نموده است .(Melagareyo et al., 2009)
کاربرد نشانگرها RFLP در بررسی روابط فیلوژنتیکی
از نشانگرها RFLP میتوان در ساخت نقشه‌هاي ژنتيكي براي بسياري از گياهان زراعي استفاده ميشود. همچنين بسياري از ژنهاي مهم از طريق پيوستگي با نشانگرهاي RFLP شناسايي شده‌اند. این نشانگر ها برای مکان یابی لوکوس های صفات کمی [4](QTL) نیز مورد استفاده قرار گرفته اند. (Tanksley et al., 1989.
معایب و مزایای نشانگرها RFLP در بررسی روابط فیلوژنی
از معایب این روش میتوان به پيچيدگي فني، زمان‌بر بودن، نياز به استفاده از مواد راديواكتيو، هزینه بسیار برای طراحی کاوشگر و همچنین نیاز به میزان بالای DNA با درجه خلوص بالا اشاره کرد (Botsteinet al., 1980; Ford- Lloyd and Panting, 1996).
همچنین کم بودن تعداد جایگاه برش در طول توالی DNA نیز از جمله عوامل محدودکننده این روش میباشد.
از مزیت های این تکنیک میتوان به هم بارز بودن نشانگر ها، قابلیت تکرار پذیری بالا و سادگی روش آن اشاره کرد(جوانمرد، 1380).
[1] Restriction Fragment Length Polymorphism
[2] Restriction enzyme
[3] Southern blotting
[4] Quantitative Trite Loci
