کاربرد توالی یابی نسل جدید تکنیک NGS را می توان برای هر ارگانیسم از جمله باکتری ها، گیاهان، حیوانات، انسان و غیره استفاده نمود. منبع DNA می تواند DNA ژنومی در تعیین توالی ژنوم)، DNA مکمل (توالی یابی DNA)-(RNA متیله برای توالی یابی اپی ژنتیک)، یا توالی خاصی از DNA، مانند محلهای اتصال عوامل رونویسی” (توالی یابی ChIP) باشد (16). این روش به طور گستردهای مورد بررسی و به طور فزایندهای در بسیاری از زمینههای تحقیقاتی اعمال میشود (۱۷). در ادامه تعدادی از کاربردهای این تکنیک در زمینههای مختلف مورد بررسی قرار می گیرند.

شناسایی جهش های مرتبط با بیماریهای ژنتیکی به وسیله توالی یابی نسل جدید (NGS)

روش NGS به طور کلی می تواند برای توالی یابی ژنهای بسیار بزرگ و همچنین ژنهای کوچک تر بیماریهای ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد و تمام نواحی اگزونی و توالیهای همراه آن را پوشش دهند. این پوشش دهی گسترده حساسیت تشخیص جهش را بیش از روشهای فعلی، که اغلب از روش غربالگری مانند SSCP استفاده میشد، بهبود داده است. در حال حاضر اختلالات تک ژنی بسیاری توسط روش مذکور توالی یابی و شناسایی شدهاند. از جمله این موارد می توان به انواع ناشنوایی، نابینایی، بیماریهای ارثی پوست، بیماریهای قلبی – عروقی و غیره اشاره نمود. با این حال ظرفیت این سیستم برای توالییابی بسیاری از ژنها به صورت تکی بسیار بالا و به نظر می رسد تقریبا نامحدود باشد (۱۸).

تشخیص و درمان سرطان به وسیله توالی یابی نسل جدید (NGS)

در حال حاضر انواع مختلفی از جهش هایی سوماتیکی تقریبا در تمامی سرطانها ظاهر میشوند. تکنیک MPS می تواند به طور همزمان اطلاعات تغییرات تعداد کپی جهش های متوالی و همجوشی ژنها را در هر نقطه از ژنوم که در ارتباط با پیشرفت بدخیمی است، ارائه کند. در عین حال، بر خلاف روش ریز ارائه ها این تکنیک محدودیتی برای ارزیابی تغییرات و انحرافات بزرگ ندارد. استفاده بالینی از توالی یابی موازی انبوه، راهی برای شناسایی علل بسیاری از بیماریهایی با علت ناشناخته را از طریق غربالگری همزمان هزاران نفر از نظر جایگاه جهش های بیماری زا و با تعیین توالی نمونههای بیولوژیکی برای بررسی ژنومی عوامل عفونی جدید فراهم میکند. علاوه بر ارائه این قابلیتهای تشخیصی کاملا جدید، این نوع توالییابی ممکن است در اینده جایگزین ارائهها و توالی یابی سانگر در برنامههای کاربردی بالینی که در حال حاضر استفاده می شود، باشد. سرطان یک بیماری بسیار هتروژن است و سلولهای مختلفی در یک تومور دیده میشوند. ممکن است جهش اصلی که مسبب بدخیمی است تنها در بخش کوچکی از ژنوم سلول دیده شود. بنابراین تشخیص آن نیاز به دقت و تمرکز بالایی دارد که روشهای قبلی قادر به چنین تشخیصی نیستند. با این حال تکنیک NGS می تواند تغییرات ژنتیکی مرتبط با سرطان که تنها در کسر کوچکی از سلولهای آزمایش شده رخ می دهند را با دقت بالایی اندازه گیری نماید. این امر به دلیل انبوه سازی مستقل و تعیین توالی میلیونها قطعه DNA مختلف از هر نمونه است که امکان تشخیص دقیق توالی نادر را محقق می نماید (۱۹).|

تشخیص ژنتیکی پیش از لانه گزینی (PGD) به وسیله توالی یابی نسل جدید (NGS)

 به منظور تشخیص ژنتیکی پیش از لانه گزینی (PGD) روشهای متفاوتی مورد استفاده قرار می گیرند. که از جمله آنها می توان به مواردی که در ادامه ذکر میشود اشاره کرد: ۱) تکنیک “FISH یا دورگه سازی درجا توسط پروب های خاص برای تشخیص آنیوپلوئیدی که بیشتر برای تشخیص ناهنجاریهای شناخته شده کروموزومی در اوایل دوران جنینی به کار برده می شود. ۲) روش CGH یا همان هیبریداسیون ژنومی مقایسهای که روند تشخیصی آن به صورت مقایسه بین DNA جنین و DNA طبیعی میباشد. اما معایبی چون محدودیت زمانی تشخیص، عدم پوشش پروتکلهای قوی برای کل ژنوم و با وجود پروتکلهای ضعیف IVF• برای بیوپسی و انجماد را نیز در بر دارد، ۳) ارائه های CGH’ نیز به عنوان تکنولوژی بهبود یافته برای تشخیص عدم تعادل کروموزومی توسعه یافته است و 4) روش غربالگری کروموزومی جامع (CCS) که همراه با PCR برای تشخیص دقیق تر آنیوپلوئیدیها انجام میشود. این در حالی است که توالی یابی نسل جدید امکان تشخیص کروموزومی به صورت جامع و گسترده را فراهم می سازد. امروزه از NGS برای شناسایی آنیوپلوئیدی و باز آراییهای کروموزومی نامتعادل پس از نمونه برداری از بلاستوسیست استفاده میشود. نمونه برداری از بلاستوسیت به صورت همزمان چندین سلول را مورد تجزیه و تحلیل قرار می دهد و محدویت وجود توالیهای پراکنده که منجر به تشخیص ضعیف در PGD میشوند را در بر نخواهد داشت (۲۰).

آشنایی با کاربرد توالی یابی نسل جدید (NGS) در فارماکوژنومیکس

 واکنش های دارویی ناخواسته یکی از علل اصلی مرگ و میر در بیماریها و سرطان می باشند. اگرچه عوامل بسیاری در این امر دخيل اند اما تنوع ژنتیکی نقش کلیدی در واکنش نامطلوب به دارو و یا در قدرت تاثیر دارو بر بیماری و درمان آن بازی میکند. تعیین توالی به روش NGS، امکان شناسایی انواع مارکرهای ژنتیکی دخیل در پاسخ به دارو را تنها در یک آزمون میدهد که این امر منجر به درمان صحیحی با دارو میشود. این روش به ویژه برای افراد مسن و افراد با بیماریهای مزمن که باید بسیاری از داروها را به صورت همزمان مصرف کنند، حائز اهمیت است (۱۷).

معرفی و آشنایی با کاربرد توالی یابی نسل جدید (NGS)  کاربرد در اپی ژنتیک

تغییرات اپی ژنتیک اصولا تغییرات سوماتیک در ژنوم می باشند به این معنی که پس از لقاح و در طول رشد جنین و در ادامه آن پس از تولد رخ میدهند. مشخص شده که این تغییرات ارتباط مستقیمی با پیشرفت برخی از سرطانها و اختلالات مادرزادی مانند سندرم سودو هیپو پاراتیروئیدیسم، سندرم بکویت ویدمن و سندرم راسل سیلور و غیره دارند. سنجشهای بالینی معمول می توانند تغییرات اپی ژنتیک در ژنهای فرد را نشان دهد، اما توالی یابی نسل جدید سنجش گستردهای از تغییرات اپی ژنتیک که به عنوان علل بیماری خاص شناخته شده اند را امکانپذیر ساخته است. برای مثال، تعیین توالی بیسولفیت اخیرا با این روش برای بررسی الگوهای متیلاسیون در سراسر ژنوم در سرطان خون انجام شده است. همچنین تغییرات هیستونینیز با استفاده از روش توالی یابی CHiP به کار گرفته شده است (۱۸).

 

آشنایی با کاربرد توالی یابی نسل جدید (NGS) در شناسایی تنوعات ساختاری در ژنوم (SVs)

تنوعات ساختاری (SVs) ، شامل تنوعات تعداد تکرار (CNVs)”، واژگونی و یا سایر باز آرایی های کروموزومی میشود که سبب تغییر در تعداد تکرارها نمیشوند. شایع ترین CNV، پلی مورفیسمها هستند. اما انواع بیماری زای آنها امروزه به عنوان یکی از علل اصلی عقب ماندگی ذهنی و برخی دیگر از نقایص در هنگام تولد محسوب می شوند. برتری NGS در این زمینه نسبت به سایر روش های قبلی مثل هیبریداسیون ژنومی ارائه ها این است که این نسل از تکنولوژی می تواند هر دو نوع از باز آراییهای متعادل و نامتعادل را شناسایی کند. وضوح بسیار بالاتر و همبستگی بیشتر ژنوتیپ- فنوتیپ از دیگر مزایای این روش نسبت به سایر روشها میباشد (۱۷).

آشنایی با مزایا و معایب توالی یابی نسل جدید (NGS)

علاوه بر کاربردهای این نسل از توالی یابی که ذکر شد، می توان به ویژگیهایی از جمله پوشش دهی بالا (عمق پوشش دهی 99x)، نیاز به میزان کم از نمونه ژنومی (50ng)، توالى یابی تک مرحله ای، مقیاس پذیری بسیار بالا، کمی سازی خاصیت RNA با کیفیت بسیار بالا، پروتکلهای آماده سازی نمونه سریع و مستقیم و کاهش زمان و هزینهها اشاره نمود. این در حالی است که این روش چالشهایی نیز در پیش رو دارد که بزرگترین آن، تجزیه و تحلیل دادهها میباشد که در سطح آزمایشهای تحقیقاتی قابل انجام بوده اما در سطح بالینی هنوز نیاز به تسریع استفاده از این دادهها و ترجمه جفت بازهای توالی در برنامه های کاربردی بالینی است. چالش بعدی، زیر ساختهای محاسباتی می باشد. در واقع مقدار دادههای اولیه در سیستمهای NGS از ظرفیت محاسباتی ترین سیستمها نیز پیشی گرفتهاند. چالش بحث برانگیز دیگر، مسائل حقوقی و اخلاقی این روش می باشد. پیامدهای قانونی و اخلاقی تعیین توالی بسیار زیاد است و تاکنون به طور کامل به آن پرداخته نشده است. به اشتراک گذاری اطلاعات ژنتیکی فرد با کارفرمایان و شرکتهای بیمه آینده نگر ممکن است منجر به تبعیض مبتنی بر اطلاعات ژنتیکی شود که می تواند پیامدهای قانونی داشته باشد (۱۹).