از زمان ابداع و معرفی توالی یابی نسل جدید تاکنون پیشرفتهای زیادی در خصوص کارایی، سرعت و بازده روش مزبور صورت گرفته که منجر به معرفی انواعی از این روش شده است.

آشنایی و معرفی روش توالی یابی کل ژنوم (WGS)

در این روش کل توالی ژنومی یک موجود (ژنوم هستهای به همراه DNA میتوکندریایی در سلولهای جانوری و DNA کلروپلاست در سلولهای گیاهی) توالی یابی می گردد. در این حالت حدود هزاران ژن فعال و نیز هزاران توالی خاموش به طور همزمان بررسی میشوند. روش WGS با پوشش دهی ۹۸/۵ درصدی توالیهای کد کننده، یکی از کارآمدترین روشها برای شناسایی جهشهای ژنتیکی است. مطالعه همبستگی ژنوم (GWAS) بر مبنای ریز ارائه از جمله پرکاربردترین روشهای تشخیص جهشهای مرتبط با بیماریهایی میباشد که در آن حدود 4 میلیون مارکر در هر نمونه مورد بررسی قرار می گیرد. با این حال این رقم در مقابل شناسایی همزمان ۳/۲ میلیارد جفت باز در روش WGS عدد کوچکی محسوب میشود (۸).

آشنایی و معرفی روش توالی یابی اگزومی (WES)

در حال حاضر، ماهیت درصد کمی از توالی ژنوم انسان مشخص شده است (۱۰٪) و اطلاعات بالینی محدودی را می توان بلافاصله از توالی ژنوم کامل یک بیمار به دست آورد. بنابر این، برای محققان بالینی مقرون به صرفه تر است که فقط توالی اگزونی (۲٪ از ژنوم نواحی رمزگذار پروتئین و یا اگزون است)، مندلیوم (نواحی مربوط به ۲۹۹۳ ژن کد کننده بیماریهای شناخته شده) ویا قطعات ژنی بیماری زا را برای غربالگری جهش مربوطه در تشخیص و درمان بیماری هدف قرار دهند. از این روش می توان برای تشخیص مولکولی اختلالات مرتبط با گروهی از ژنها استفاده نمود. بدین منظور، نیاز است تا ژن هدف برای جلوگیری از دخالت سایر نواحی باقی مانده از ژنوم، تا دهها یا هزاران بار بیشتر از میزان آن در ژنوم غنی شود (۹ و۱۰).

توالی یابی کل اگزونهای ژنوم (اگزوم) در تشخیصهای بالینی بسیار ارزشمند است و دیدی جامع از آرایش ژنتیکی یک بیماری ارائه میدهد. با جود آن که اگزونها تنها ۲٪ از کل ژنوم را به خود اختصاص داده اند، اما در حدود ۸۰٪ از جهشهای مولکول DNA که مسبب بسیاری از بیماریهای ژنتیکی در انسان است را شامل میشوند (۱۱). در واقع تعیین توالی اگزومی که اخیرا وارد تحقیقات ژنتیک پزشکی شده است، تا به حال نقش بیش از هزاران ژن را در اختلالات مندلی مشخص کرده است و این آمار به سرعت در حال رشد است (۱۲).

آشنایی با مراحل روش توالی یابی اگزومی (WES)

نحوه انجام توالی یابی اگزومی بدین صورت است که در ابتدا DNA ژنومی به صورت تصادفی قطعه قطعه شده و سپس آداپتورها به کتابخانه حاصله متصل می شوند. سپس کتابخانه برای توالیهای اگزونی غنی شده و در مرحله بعد، قطعات با RNA یا DNA بیوتینیله شده هیبرید شده و به دنبال آن تعیین توالی به صورت گسترده Massive Parallel Sequencing, MPS انجام گرفته و در نهایت دادههای حاصله، تجزیه و تحلیل، نقشه برداری، تنظیم و خوانده میشوند (شکل ۲)

معرفی کاربرد توالی یابی اگزومی (WES)

مواردی که در آن توالی یابی اگزومی توصیه می شود عبارتند از: ۱) فنوتیپ های هتروژن (حالتی که در آن جهش در ژنهای متعدد به تظاهرات بالینی یکسان منجر می شود، مانند عقب ماندگی ذهنی، تاخیر در رشد، کوتاهی قد، کاردیومیوپاتی، ناشنوایی، اختلالات متابولیک، بدشکلی های پیچیده، بیماریهای عضلانی، نابینایی ارثی، بیماریهای قلبی – عروقی و …، ۲) فنوتیب های کاملا نامشخص و یا مجموعه ای از علائم که تشخیص افتراقی را با مشکل مواجه می کند و ۳) ژنهای بزرگ نظیر ژن دیستروفین (۸). در شکل ۳ به عنوان متال تشخیص بیماری زالی (آلبینیسم) با روش توالی یابی اگزومی نشان داده شده است. همانگونه که در شکل قسمت a و b دیده می شود، علائم مشاهده شده در فرد مراجعه کننده مشابه فنوتیب معمول بیماران مبتلا به آلبینیسم نوع ؛ است و لذا این بیماری برای فرد تشخیص داده می شود. شجره نامه فرد مذکور نیز در بخش C نشان داده شده است. نقاط نشاندار شده در آیدیوگرام قسمت d، نشان دهنده نواحی هموزیگوت در ژنوم این فرد هستند که با استفاده از روش آنالیز ارائه پلی مورفیسمهای تک نوکلئوتیدی ” شناسایی شدند. پس از این مرحله، نواحی هموزیگوت به روش توالی یابی اگزومی مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت دو جهش عامل بیماری آلبینیسم نوع ؛ در این فرد شناسایی شد. قسمت e کروماتوگرام حاصل از توالی یابی اگزومی را برای ژن SLC 45A2 و قسمت f کروماتوگرام حاصل از توالی یابی اگزومی را برای ژن 3 COPC نشان میدهد که فرد برای هر دو حاوی جهش هموزیگوت است. این مثال اهمیت تکنیک NG S برای تائید صحت تشخیصبیماری را به خوبی به نشان می دهد. (۸).

آشنایی با انواع روشهای توالی یابی اگزومی (WES)

برای شناسایی جهشهای مرتبط با بیماریهای ژنتیک بر اساس توالی یابی اگزومی حداقل شش روش معرفی شده است (شکل ؛). در روش اول که روش پیوستگی ” نامیده می شود، تمامی افراد مبتلای خانواده تعیین توالی شده و از لحاظ تنوعات مشابه مورد بررسی قرار می گیرند. به علاوه می توان محتوای اگزونی اعضای غیر مبتلا را نیز تعیین توالی نموده و به این ترتیب تنوعات غیربیماری زا را شناسایی نمود. برای متال خواهر و برادری که هر دو مبتلا هستند، دارای ۵۰ درصد مشابهت DNA میباشند و داننستن این موضوع سبب می شود که بخشی از تغییرات جهشی (واریانت های) مشکوک حذف شوند (با مشخص نمودن واریانت های مشترک و غیر مشترک). در روش دوم که مبتنی بر هموزیگوسیتی ” است، فرض بر این است که فرد مبتلا به بیماری مغلوب، واریانت های جهش دار خود را از هر دو والد دریافت کرده است. بنابراین واریانت هایی دنبال می شوند که در والدین به صورت هتروزیگوت و در فرد مبتلا به صورت هموزیگوت هستند (۱). در روش بعدی که استراتژی دو ضربه “نامیده میشود زمانی استفاده می شود که تنها یک فرد در دسترس است و دیگر اعضای خانواده حضور ندارند و تصور میرود بیماری حالت مغلوب دارد. در این حالت میتوان توالی یابی اگزومی انجام داده و در نتایج حاصل به دنبال واریانتهای هموزیگوت و یا واریانتهای هتروزیگوت مرکب بود. روش چهارم که استراتژی همپوشان نامیده میشود زمانی مورد استفاده قرار می گیرد که چندین فرد مبتلای غیر خویشاوند با فنوتیپ یکسان مراجعه می نمایند. این روش به خصوص در مورد بیماری هایی که حالت غالب دارند مورد استفاده قرار می گیرد. در مواردی که بیماری به شدت هتروژن است و نیز در مواردی که بیماری به شدت تک گیر است، روش پنجم که استراتژی de novo نامیده میشود مورد استفاده قرار می گیرد. در این حالت به دنبال واریانتهای جدید در مجموعه اطلاعات حاصل از توالی یابی اگزومی فرد هستیم در نهایت روش ششم که استراتژی مبتنی بر ژنهای کاندید نامیده میشود، به دنبال واریانتهای شناخته شده از بیماری در نتیجه تعیین توالی فرد می باشیم (14).

(a) روش پیوستگی که در آن تمامی افراد مبتلای خانواده تعیین توالی شده و از لحاظ تنوعات مشابه مورد بررسی قرار می گیرند. (b) روش مبتنی بر همرزیگوسیتی که در آن فرض بر این است که فرد مبتلا به بیماری مغلوب، واریانتهای جهش دار خود را از هر دو والد دریافت کرده است. (c) استراتژی دو ضربه، این روش زمانی استفاده میشود که تنها یک فرد در دسترس است و دیگر اعضای خانواده حضور ندارند و تصور می رود بیماری حالت مغلوب دارد. (d) استراتژی همپوشان، این روش زمانی مورد استفاده قرار می گیرد که چندین فرد مبتلای غیر خویشاوند با فنوتیپ یکسان مراجعه می نمایند. (e) استراتژی de novo؛ در این حالت به دنبال واریانتهای جدید در مجموعه اطلاعات حاصل از WES فرد هستیم. (f) استراتژی مبتنی بر ژنهای کاندید که در آن به دنبال واریانتهای شناخته شده از بیماری در نتیجه تعیین توالی فرد می باشیم.

لازم به ذکر است که با وجود این که تعیین توالی اگزوم همه نواحی کد کننده پروتئین در ژنوم انسان را پوشش میدهد، این روش در تشخیص جهش های دخیل در وراثت سه آللی، اثرات اپی ژنتیکی، تغییرات تعداد کپی و برخی نقاط کور ژنوم مانند مناطق بسیار تکراری و مناطق غنی از GC دارای محدودیتهایی است (۸).

آشنایی با روش توالی یابی هدفمند ژنوم

گرچه امروزه توالی یابی کل ژنوم و توالی یابی اگزونی به راحتی قابل انجام هستند، اما در بسیاری از موارد بیماری توالی یابی هدفمند ارجحیت پیدا می کند. چرا که توالییابی هدفمند از لحاظ زمانی و هزینه مقرون به صرفه بوده و نواحی بیشتری از نقاط ژنومی مدنظر را پوشش می دهد. بر این اساس پانلهای (مجموعه های اختصاصی هزاران ناحیه ژنومی که نقاط داغ جهش در بیماریهای مختلف هستند طراحی شدهاند. این پانلها تنها یک ناحیه خاص ژنومی را تحت پوشش قرار می دهند. به علاوه پانلها را می توان بر اساس نیاز محقق یا پزشک به طور اختصاصی طراحی کرد و مورد استفاده قرار داد. امروزه برای بررسی بیماریهای متعدد مانند انواع بیماریهای متابولیک از جمله بیماریهای ذخیره لیزوزومی، رتینوپیگمنتو زوم، ناشنوایی غیر سندرومی، میوکاردیوپاتیها و انواع سرطان، پانلهای اختصاصی طراحی شده است (۸). روز به روز لیست پانلها در حال گسترش است و در حال حاضر تقریبا برای تمامی ژنها و بیماریهای شناخته شده ژنتیکی حداقل یک پانل ژنی معرفی شده و در دسترس می باشد.

آشنایی با روش های توالی یابی RNA

با توجه به این که توالی یابی کل RNA سلولی (رونوشتهای سلولی امکان تصویر یابی از محتوای ژنی سلول را به خوبی فراهم می نماید، از اهمیت کاربردی بالایی برخوردار است. در توالی یابی RNA، قبل از ساخت کتابخانه NGS، كل محتوای RNA سلول خارج شده و به cDNA تبدیل میشود. این روش در واقع برای RNA، mRNAهای کوچک، RNAهای غیر کد شونده و یا میکرو RNAها قابل انجام است (۸).

5-3- توالی یابی DNA میتوکندریایی تعداد تکرارهای DNA میتوکندریایی بسیار متغیر بوده و گمان بر این است که این امر با وقوع اختلالات بسیاری از جمله سرطان در ارتباط باشد. روشهای سنتی شمارش این تعداد تکرارها اکثرا با PCR همراه بوده، اما اخیرا تکنیکهای جدیدی بر پایه روشهای توالی یابی تعداد تکرارهای mtDNA و همچنین تهیه پروفایل بیانی، ایجاد و گسترش یافته اند. در این راستا ارزیابی محتویات mtDNA توسط توالی یابی اگزوم برای تشخیص دقيق اختلالات میتوکندریایی به کار برده شده است. علاوه بر این، توالی یابی DNAمیتوکندریایی توسط روشهای نوین می تواند اطلاعات سودمندی را در مورد ارتباط جهشهای mtDNA با پروفایل بیانی ژن در مسیرهای سلولی سنتز mtDNA و تاثیر گذاری مستقیم و یا غیر مستقیم داروهای ضدسرطان در اختیار محققان قرار دهد (15).