روش‌های Gibson و NEBuilder® HiFi دو روش تقریباً مشابه برای اتصال توالی ها به یکدیگر می شود که می‌توان از آن برای کلون نمودن توالی ها نیز استفاده نمود. تفاوت این دو روش در طول قطعاتی می باشد که می‌توان کلون نمود که روش NEBuilder® HiFi از روش Gibson در کلون نمودن قطعات طولانی‌تر کارایی بیشتری دارد همچنین با کیت‌هایی که برای روش NEBuilder® HiFi تهیه شده است می‌توان توالی های تک رشته DNA را نیز به هم متصل و یا کلون نمود.
اصول کلونینگ ژن ها با روش Gibson و NEBuilder® HiFi کلونینگ
اصول کلونینگ در این دو روش مشابه بوده که در ادامه این اصول ارائه خواهد شد.
در شکل فوق مراحل اتصال دو توالی A و B توسط روش‌های Gibson و NEBuilder® HiFi نمایش داده شده است.
در مرحله اول دو توالی A و B باید در محل اتصال خود دارای یک قسمت همپوشان به طول 15 تا 25 نوکلئوتید باشند که با استفاده از طراحی پرایمر مناسب می‌توان این ناحیه همپوشان را ایجاد نمود. دمای Tm مناسب برای قطعه همپوشان برابر ویا بیشتر از با 48 درجه سانتی گراد می باشد که البته به کیت مورد استفاده نیز بستگی دارد.
در مرحله دوم یک اگزونوکلئاز رشته 5 پریم ناحیه همپوشان را تخریب می‌نماید اما رشته 3 پریم دست‌نخورده باقی می ماند بنابراین در اثر فعالیت اگزونوکلئازی رشته‌های 3 پریم چسبنده‌ای بر روی دو قطعه تولید می شود که مکمل یکدیگر می‌باشند.
در مرحله سوم رشته‌های 3 پریم چسبنده‌ای که در مرحله قبل بر روی قطعات مختلف ایجاد شده اند به یکدیگر متصل می‌شوند و به عنوان پرایمر برای فعالیت آنزیم DNAپلیمراز عمل می نمایند با فعالیت آنزیم DNAپلیمراز شکاف‌های بین دو قطعه A و B پر می شود.
در مرحله چهارم آنزیم لیگاز با ایجاد پیوند کوالانسی هر دو توالی را به هم متصل می‌نماید.
در شکل فوق مراحل اتصال دو قطعه به یکدیگر را شرح دادیم برای کلون نمودن توالی ها نیز مراحل کلونینگ به همان صورت فوق می باشد با این تفاوت که باید از وکتور خطی شده برای کلونینگ استفاده نمود.
اصول کلون نمودن توالی ها در روش‌های Gibson و NEBuilder® HiFi تا حدودی مشابه روش in-fusion cloning می باشد و در روش‌های Gibson و NEBuilder® HiFi نیز باید وکتور را به حالت خطی تبدیل نمود و برای تکثیر insert دو پرایمر طراحی نمود که دارای ناحیه همپوشان با دو بازوی وکتور باشد.
برای خطی نمودن وکتور در روش‌های Gibson و NEBuilder® HiFi نیز می‌توآن‌همانند روش in-fusion cloning از آنزیم محدودگر و یا روش PCR استفاده نمود.
همانگونه که قبلا ذکر شد بهترین روش تولید وکتور خطی استفاده از دو آنزیم محدودگر مختلف می باشد زیرا سبب می شود که دو طرف وکتور خطی به یکدیگر متصل نشوند. بعد از هضم آنزیمی وکتور، دو انتهای تولید شده برای وکتور خطی در سه وضعیت قرار می‌گیرند:
1: در صورتی که از آنزیم های محدودگر blunt ایجاد شود انتهای وکتور فاقد توالی تک رشته‌ای چسبان می باشد
2: در صورتی که از آنزیم های محدودگر غیر blunt استفاده شود ممکن است انتهای خطی شده وکتور دارای یک قسمت تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 5 پریم باشد (5 overhange).
3: در صورتی که از آنزیم های محدودگر غیر blunt استفاده شود ممکن است انتهای خطی شده وکتور دارای یک قسمت تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 3 پریم باشد (3 overhange)
طراحی پرایمر برای insert در هر یک از حالت‌های فوق مقداری متفاوت می باشد.
در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر دو انتهای blunt برای وکتور ایجاد گردد ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمرهای insert را باید دقیقا از دو انتهای وکتور طراحی نمود.
در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر دو انتهای تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 5 پریم (5 overhange) برای وکتور ایجاد گردد ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمرهای insert را باید دقیقا از اولین نوکلئوتید رشته 3 پریم وکتور طراحی نمود و انتهای 5 پریم چسبنده را نادیده گرفت که این روش عکس روش in-fusion cloning می باشد.
و در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر دو انتهای تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 3 پریم (3 overhange) برای وکتور ایجاد گردد ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمر را باید دقیقا از اولین نوکلئوتید رشته 3 پریم وکتور طراحی نمود
نحوه طراحی پرایمر برای کلون نمودن ژن ها به روش های Gibson و NEBuilder® HiFi
طراحی پرایمر برای روش‌های Gibson و NEBuilder® HiFi دارای اهمیت فراوانی می باشد. به صورت کلی پرایمرهای طراحی شده دارای سه قسمت می باشد به ترتیب از سمت 5 پریم شامل:
1: ناحیه مکمل با وکتور (یا قطعه‌ای که باید به آن متصل شود) که طول این قسمت باید بین 15 تا 25 نوکلئوتید باشد. طول این ناحیه به میزان باز های C و G توالی بستگی دارد. هر چه میزان باز های C و G بیشتر باشد طول ناحیه همپوشان کوتاه‌تر و هرچه میزان باز های C و G کمتر باشد طول توالی همپوشان بیشتر می باشد. همچنین اگر چند insert به صورت همزمان کلون می‌شوند بهتر است طول قطعه همپوشان بلندتر در نظر گرفته شود.
2: ناحیه ویرایشی پرایمر که محل افزودن لینکر و یا تگ هایی مانند هیستیدین می باشد. علاوه بر این برای طراحی پرایمرهای in-frame باید افزودن و یا حذف نوکلئوتیدها از پرایمرها در مرز این قسمت با قسمت مکمل با وکتور صورت پذیرد.
توجه نمایید که لینکر و یا تگ هایی که به پرایمر اضافه می شود باید با insert (ناحیه مکمل با insert پرایمر) در یک چهارچوب خوانش صحیح قرار گیرند.
3: ناحیه مکمل با insert. طول این ناحیه بین 18 تا 25 باز می باشد. بهتر است دمای Tm برای این قسمت 58 درجه در نظر گرفته شود و سایر ویژگی‌های یک پرایمر عمومی را نیز دارای باشد که مهم‌ترین آن‌ها عدم تشکیل ساختار ثانویه در انتهای 3 پریم پرایمرها می باشد.
