آموزش کلون نمودن ژن ها با روش gateway cloning ، اصول کلونینگ و طراحی پرایمر -

آموزش کلون ژن ها با روش gateway cloning

مقدمه ای بر کلون نمودن ژن ها با روش gateway cloning

روش gatway cloning بر اساس مکانیسم ادغام باکتریوفاژ λ درون ژنوم باکتری E coli طراحی شده است. بر روی فاژ λ یک جایگاه به نام attP قرار دارد و بر روی ژنوم باکتری جایگاه attB قرار گرفته است که با بروز نوترکیبی بین این دو جایگاه، ژنوم فاژ λ درون ژنوم باکتری ادغام می شود که به این فرایند BP reaction گفته می شود. با ادغام فاژ λ درون باکتری دو جایگاه جدید به نام attL و attR ایجاد می شود. در فرایندی معکوس که LR reaction نام دارد با فاژ λ می‌تواند با ادغام جایگاه های attL و attR با یکدیگر از ژنوم باکتری خارج شود.

مراحل انجام کلونینگ ژن ها با روش gateway cloning : طراحی پرایمر برای این روش به چه صورت می باشد؟

مراحل کلون نمودن ژن ها با روش gateway cloning شامل مراحل زیر می باشد.

مرحله اول: ابتدا باید برای دو طرف توالی insert یک جفت پرایمر طراحی می گردد که دارای جایگاه attB در سمت 5 پریم خود باشند بدین طریق بعد از تکثیر قطعه insert در دو طرف آن، دو توالی attB قرار می‌گیرد.

مرحله 2: در مرحله بعد insert تکثیر شده در یک وکتور که دارای جایگاه‌های attP می باشد (این وکتور با نام Donor vector شناخته می شود) کلون می شود. بنابراین وکتورهایی که در این مرحله استفاده می‌شوند باید دارای جایگاه‌های attP باشند و از هر وکتوری نمی‌توان استفاده نمود. در اثر فعالیت یک آنزیم به نام آنزیم کلوناز جایگاه‌های attB با attP در اثر نوترکیبی با یکدیگر ادغام می‌شوند و در وکتور نوترکیب دو جایگاه attL در دو طرف insert ایجاد می شود که در شکل فوق با جایگاه attL1 و attL2 مشخص شده اند. در این مرحله جایگاه‌های attP و attB با هم ادغام می‌شوند جایگاه attL را تولید می نمایند به همین دلیل به مرحله BP cloning گفته می‌شود.

نکته مهم در این مرحله این است که چند نوع attp وجود دارد مانند attP1، attP2، attP3، attP4، attP5 و …..علاوه بر این برای attB نیز چندین نوع مختلف وجود دارد مانند attB1، attB2، attB3، attB4 و …. از آنجایی که جایگاه‌های attP با جایگاه‌های attB متناظر خود ادغام می شوند (به عنوان مثال attP1 با attB1 و attP2 با attB2 ادغام می‌شوند) قبل از این مرحله باید جایگاه‌های attP را بر روی وکتور شناسایی نمایید و برای پرایمرها توالی مناسبی را به عنوان attB انتخاب نمایید.

نکته مهم دیگر اینکه چند نوع توالی attL وجود دارد مانند attL1، attL2، attL3 و …. که از ترکیب جایگاه‌های attB و attP متناظر خود ایجاد می‌شوند به عنوان مثال با ادغام attP1 با attB1 جایگاه attL1 و با ادغام attP2 با attB2 جایگاه attL2 ایجاد می شود.

کلون Entry و مزایای استفاده از این وکتور در کلونینگ gateway چیست

وکتوری نوترکیبی که در این مرحله به دست می‌آید کلون Entry نام دارد. عملکرد کلون Entry مشابه وکتور TA برای کلونینگ با آنزیم های محدودگر می باشد. بنابراین کلون Entry وکتور اصلی برای کلونینگ نیست بلکه یک وکتور کمکی می باشد و در مرحله بعد باید توالی کلون شده در کلون Entry به درون وکتور اصلی منتقل شود. حال این سؤال پیش می‌آید که چرا توالی insert مستقیماً درون وکتور اصلی کلون نمی‌شود.

یکی از دلایل مهم این است که بعد از کلون نمودن insert درون کلون Entry می‌توان به‌راحتی insert را درون هر وکتور دلخواه دیگر کلون نمود. البته منظور از هر وکتور دلخواه، وکتوری می باشد که دارای توالی های attR باشد.

مرحله 3 کلون نمودن insert از کلون Entry به درون وکتور اصلی می باشد.

در مرحله سوم باید insert که درون کلون Entery قرار دارد به درون کلون اصلی کلون شود. بر روی کلون Entery جایگاه attL قرار گرفته است و بر روی وکتور اصلی جایگاه attR قرار دارد که این دو جایگاه با یکدیگر ادغام می‌شوند و جایگاه attB را بر روی وکتور نوترکیب اصلی ایجاد می نمایند به همین دلیل به این مرحله LR کلونینگ گفته می‌شود.

نکته مهم دیگر اینکه چند نوع توالی attR وجود دارد مانند attR1، attR2، attR3 و …. از آنجایی که جایگاه‌های attR با جایگاه‌های attL متناظر خد ادغام می شوند(attR1 با attL1 و attR2 با attL2 ادغام می‌شوند) بنابراین ابتدا باید جایگاه‌های attR را بر روی وکتور اصلی شناسایی نمایید و برای پرایمرهای insert توالی مناسبی را به عنوان attB انتخاب نمایید تا سرانجام توالی attL مناسب بر روی کلون entry ایجاد شود.