TA کلونینگ چیست؟
TA کلونینگ یک روش برای کلون نمودن محصولات PCR است. استفاده از آنزیم taq در PCR سبب اضافه شدن یک نوکلئوتید A به انتهای 3 پریم محصولات PCR می شود که از همین A اضافه شده برای کلون نمودن محصول PCR در وکتور TA استفاده می‌شود. وکتورهای TA وکتورهایی خطی می‌باشند که دارای یک باز T چسبنده در دو انتهای توالی خود می‌باشند که مکمل باز A در دو طرف محصول PCRمی‌باشند و روش TA کلونینگ مبتنی بر اتصال نوکلئوتیدهای A و T در قطعات مختلف DNA با یکدیگر است.
شکل فوق نحوه TA کلونینک را نشان می دهد و اتصال وکتور و قطعه مورد نظر در حضور آنزیم لیگاز باعث جفت شدن A و T های انتهای توالی ها و سبب ادغام محصول PCR با وکتور TA می شود.
مزیت روش TA در کلونینگ ژن ها چیست
از مزیت‌های این روش این است که وکتور TA دارای چندین جایگاه شناسایی برای آنزیم های محدودگر مهم در دو طرف جایگاه کلون شدن توالی insert می‌باشند. بنابراین در صورتی که آنزیم های موجود در وکتور TA با آنزیم ها وکتور اصلی برای کلونینگ مطابق باشد دیگر نیازی به اضافه نمودن جایگاه شناسایی آنزیم های محدودگر بر روی پرایمرها برای تکثیر insert نمی‌باشد.
نکته: باید توجه داشت که استفاده از جایگاه‌های شناسایی آنزیم های TA سبب افزودن چند نوکلئوتید اضافی به توالی insert خواهد شد و ممکن است سبب خارج شدن توالی insert از فریم خوانش صحیح شود. بنابراین در مواقعی که حفظ فریم خوانش insert ضروری باشد بهتر است جایگاه شناسایی آنزیم های محدودگر بر روی پرایمر ها قرار گیرند.
مزیت دوم روش TA کلونینگ این است که در مرحله هضم آنزیمی می‌توان از هضم درست قطعات اطمینان حاصل نمود. اصولاً آنزیم ها محدودگر برای برش زدن قطعاتی که جایگاه شناسایی آنزیم در انتهای توالی قرار گرفته باشد دچار مشکل می‌شوند و نمی‌توانند هضم آنزیمی را درست انجام دهند. اما هنگامی که توالی insert درون وکتور TA کلون می شود آنزیم های محدودگر می‌توانند نقش خود را به خوبی انجام دهند. شکل فوق الگوی باندهای یک توالی کلون شده در TA (سمت راست) و یک توالی کلون نشده (سمت چپ) را بعد از هضم آنزیمی بر روی ژل الکتروفورز نشان می‌دهد. همانگونه که قابل مشاهده می باشد توالی برش خورده برای ژل سمت راست از توالی برش نخورده قابل تمایز می باشد در حالی که برای ژل سمت چپ این تمایز چندان قابل تشخیص نمی‌باشد.
معایب روش TA کلونینگ در کلونینگ ژن ها چیست؟
یکی از معایب این روش TA کلونینگ عدم مشخص بودن جهت کلون شدن insert در وکتور TA می‌باشد به دلیل این که توالی insert در هر دو جهت دارای نوکلئوتید A چسبنده وکتور TA نیز در هر دو طرف دارای نوکلئوتید T چسبنده می باشد امکان دارد insert در هر جهتی در وکتور TA کلون شود و به این مفهوم می باشد که توالی insert به میزان ۵۰٪ در جهت نامناسب کلون خواهد شد (در شکل فوق insert با رنگ قرمز نشان داده شده است)۔ بنابراین بعد از کلون شدن insert در وکتور TA باید با استفاده از پرایمرهایی که بر روی بدنه وکتور و insert وجود دارد جهت کلون شدن insert را تعیین نمود سپس از آنزیم های محدودگری که وکتور TA فراهم می‌آورد استفاده نمود. اما در صورتی که جایگاه شناسایی آنزیم ها بر روی پرایمرها قرار گرفته باشد نیازی به تعیین جهت insert بر روی وکتور TA نمی‌باشد زیرا نیازی به استفاده از آنزیم های محدودگر وکتور نمی‌باشد.
یک پاسخ
باسلام و تشکر از مطالب خوبتون
بسیار مفید بود🌹