مقدمه ای بر کلونینگ ژن ها با روش infusion cloning
روش کلونینگ In‑Fusion (In‑Fusion Cloning) یک روش بسیار کارآمد کلونینگ می باشد که مستقل از آنزیم لیگاز می باشد بنابراین در این روش نیازی به استفاده از آنزیم ها محدودگر و آنزیم لیگاز نمی‌باشد. این روش بر اساس وجود توالی های همپوشان بر روی دو طرف توالی insert و محل ادغام آن در وکتور و همچنین سیستم ترمیمی باکتری ها استوار می باشد.
با روش In‑Fusion Cloning می‌توان کلونینگ همزمان چند توالی در یک وکتو را در یک مرحله و به آسانی انجام داد و گفته کسانی که این روش را ابداع نموده اند میزان کارایی این روش بیش از 95 درصد می باشد.
روش کلونینگ In‑Fusion بر اساس وجود توالی های همپوشان بر روی دو طرف توالی insert و محل ادغام آن در وکتور استوار می باشد. در این روش ابتدا باید وکتور را در محلی که ادغام باید صورت گیرد به حالت خطی تبدیل نمود تا یک وکتور خطی حاصل شود در مرحله بعد باید پرایمرهای تکثیر insert را طراحی نمود که انتهای 5 پریم پرایمرهای طراحی شده باید با دو طرف وکتور دارای 12 تا 20 جفت باز همپوشان باشند که البته طول بهینه توالی همپوشان 15 جفت باز می باشد.
بعد از تکثیر insert با پرایمر های طراحی شده در دو طرف insert دو جایگاه همپوشان با وکتور وجود خواهد داشت که برای کلونینگ مورد استفاده قرار خواهد گرفت و با کمک آنزیم های خاص insert با استفاده از همین دو توالی همپوشان درون وکتور کلون می شود.
مراحل انجام کلونینگ ژن ها با روش infusion cloning
همانگونه که قبلا گفته شد بعد از تکثیر insert با پرایمرها، دو جایگاه همپوشان در دو طرف insert با وکتور ایجاد می شود که توالی مناطق همپوشان در شکل فوق با رنگ های قرمز و سبز نشان داده شده است.
در مرحله بعد یک اگزونوکلئاز توالی وکتور و insert را در رشته 3 پریم تخریب می کند اما رشته 5 پریم سالم می ماند بنابراین حاصل کار ایجاد رشته‌های 5 چسبنده در دو طرف وکتور و insert می باشد که مکمل یکدیگر می باشند.
در مرحله بعد به دلیل اینکه رشته‌های 5 چسبنده در دو طرف وکتور و insert مکمل همدیگر می باشد به هم متصل می‌شوند. بعد از اتصال رشته‌های مکمل به یکدیگر تنها 4 شکاف غیر کوالان در بدنه وکتور باقی می ماند که این شکاف ها توسط سیستم ترمیمی باکتری شناسایی و ترمیم می‌شوند.
با روش کلونینگ In‑Fusion می‌توان چندین insert را به صورت همزمان در یک وکتور کلون نمود برای این کار باید طراحی پرایمرها را به گونه ای انجام داد که نواحی همپوشان بین قطعات ایجاد شود.
اصول طراحی پرایمر در روش کلونینگ In‑Fusion برای کلون نمودن ژن ها
طراحی پرایمر برای روش کلونینگ In‑Fusion دارای اهمیت فراوانی می باشد. به صورت کلی پرایمرهای طراحی شده دارای سه قسمت می باشد به ترتیب از سمت 5 پریم شامل:
1: ناحیه مکمل با وکتور که طول این قسمت باید بین 12 تا 20 نوکلئوتید باشد. طول این ناحیه به میزان باز های C و G توالی بستگی دارد. هر چه میزان باز های C و G بیشتر باشد طول ناحیه همپوشان کوتاه‌تر و هرچه میزان باز های C و G کمتر باشد طول توالی همپوشان بیشتر می باشد. همچنین اگر در کلونینگ تنها یک insert وجود داشته باشد بهتر است طول بهینه قطعه همپوشان 15 باز باشد اما اگر چند insert به صورت همزمان کلون می‌شوند بهتر است طول قطعه همپوشان 20 باز در نظر گرفته شود.
2: ناحیه ویرایشی پرایمر که محل افزودن لینکر و یا تگ هایی مانند هیستیدین می باشد. علاوه بر این برای طراحی پرایمرهای in-frame باید افزودن یا حذف نوکلئوتید ها در مرز این قسمت با قسمت مکمل با وکتور صورت پذیرد.
توجه نمایید که لینکر و یا تگ هایی که به پرایمر اضافه می شود باید با insert (ناحیه مکمل با insert پرایمر) در یک چهارچوب خوانش صحیح قرار گیرند.
دراین قسمت منظور از لینکر توالی های اسیدآمینه ای می باشند که رابط دو توالی مختلف می باشند. به عنوان مثال بین دو توالی کد کنند پروتئین یک لینکر که دارای جایگاه برش آنزیم های پپتیداز می باشد قرار می دهند تا بعد از بیان ژن نوترکیب بتوان پپتیدهای حاصل از این دو توالی کد کننده را برش و از هم جدا نمود.
3: ناحیه مکمل با insert. طول این ناحیه بین 18 تا 25 باز می باشد. بهتر است دمای Tm برای این قسمت 58 درجه در نظر گرفته شود و سایر ویژگی‌های یک پرایمر عمومی را نیز دارای باشد که مهم‌ترین آن‌ها عدم تشکیل ساختار ثانویه در انتهای 3 پریم پرایمرها می باشد.
قبلا اشاره نمودیم که در روش infusion cloning وکتور باید حالت خطی داشته باشد، برای خطی نمودن وکتور می‌توان از آنزیم های محدودگر استفاده نمود. بهترین روش تولید وکتور خطی استفاده از دو آنزیم محدودگر مختلف می باشد زیرا سبب می شود که دو طرف وکتور خطی به یکدیگر متصل نشوند. بعد از هضم آنزیمی وکتور، دو انتهای تولید شده برای وکتور خطی در سه وضعیت قرار می‌گیرند:
1: در صورتی که از آنزیم های محدودکننده blunt ایجاد شود انتهای وکتور فاقد توالی تک رشته‌ای چسبان می باشد
2: در صورتی که از آنزیم هایی محدودکننده غیر blunt استفاده شود ممکن است انتهای خطی شده وکتور دارای یک قسمت تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 5 پریم باشد (5 overhange).
3: در صورتی که از آنزیم های محدودکننده غیر blunt استفاده شود ممکن است انتهای خطی شده وکتور دارای یک قسمت تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 3 پریم باشد (3 overhange)
طراحی پرایمر برای تکثیر insert در هر یک از حالت‌های فوق مقداری متفاوت می باشد.
در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر دو انتهای blunt برای وکتور ایجاد گردد ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمرهای insert را باید دقیقا از دو انتهای وکتور طراحی نمود.
در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر دو انتهای تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 5 پریم (5 overhange) وکتور ایجاد گردد ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمر insert را باید دقیقا از اولین نوکلئوتید رشته 5 پریم وکتور طراحی نمود.
و در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر دو انتهای تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 3 پریم (3 overhange) وکتور ایجاد گردد ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمر insert را باید دقیقا از اولین نوکلئوتید رشته 5 پریم وکتور طراحی نمود و انتهای 3 پریم چسبنده را نادیده گرفت.
در صورتی که بعد از خطی نمودن وکتور با آنزیم های محدودگر یک انتهای تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 3 پریم (3 overhange) و یک انتهای تک رشته‌ای چسبنده در انتهای 5 پریم (5 overhange) برای وکتور ایجاد گردد باید انتهای 3 پریم چسبنده را نادیده گرفت و ناحیه مکمل وکتور بر روی پرایمرهای insert را باید دقیقا از اولین نوکلئوتید رشته 5 پریم وکتور طراحی نمود.
یکی دیگر از روش‌های خطی نمودن وکتور در روش in fusion cloning استفاده از PCR و دو پرایمر فوروارد و معکوس در دو طرف جایگاه insertion می باشد. البته به دلیل اینکه معمولا طول وکتورها طولانی می باشد با استفاده از PCR معمولی نمی‌توان خطی نمودن وکتور را انجام داد و این کار نیازمند آنزیم های پلیمرازی خاص می باشد.
برای خطی نمودن وکتور می‌توان طراحی پرایمر را به صورتی انجام داد که قسمتی از وکتور حذف شود. در شکل فوق ناحیه بین دو پرایمر حذف می شود.
علاوه بر حذف قسمتی از وکتور می‌توان با اضافه نمودن یک توالی (مانند یک تگ خاص مانند تگ ها و یا لینکرها) به انتهای 5 پریم پرایمرها این توالی را نیز به وکتور اضافه نمود. البته باید توجه نمود که قسمت اضافه شده باید در چهارچوب خوانش وکتور اضافه شود.
