کاربرد آنزیم های محدودگر در کلون نمودن ژن ها

آنزیم‌های محدودگر یا محدود کننده از گروه آنزیم‌های اندونوکلئاز می‌باشند و همانند قیچی DNA را در محل‌های ویژه‌ای با توالی نوکلئوتیدی خاص قطع می‌کنند و برای آن که  DNAقابل برش با آنزیم باشد لازم است که دارای این توالی نوکلئوتیدی ویژه باشد . توالی‌هایی از DNA که به‌وسیله‌ی آنزیم شناسایی می‌شوند را جایگاه شناسایی (recognition sites) می‌گویند که معمولاً 4-8 جفت نوکلئوتید دارد و عمدتاً «پالیندرومی» می‌باشند، یعنی هر دو رشته دارای توالی یکسان ولی عکس یکدیگرند.

منظور از انتهای چسبنده (sticky end) و انتهای صاف ( blunt end ) برای آنزیم های محدودگر چیست

این آنزیم‌ها توسط اکثر باکتری‌ها تولید می‌شوند و تاکنون بیش از 1200 نوع از آن‌ها شناسایی شده اند. اندونوکلئازها را از نظر شیوه‌ی عملکردشان در سه گروه قرار می‌دهند که از آن میان نوع II در کلونینگ ژن کاربرد و اهمیت دارد چراکه آنزیم‌های نوع II انتهای چسبنده تولید می‌کنند (مانند شکل زیر قسمت A).

بسیاری از اندونکلئاز‌های محدود کننده برش ساده‌ای را در میان جایگاه شناسایی بر روی DNA دو رشته‌ای ایجاد می‌کنند و نتیجه‌ی آن ایجاد دو انتهای صاف یا blunt end می‌باشد. این آنزیم‌ها نوع I آنزیم های محدودگر می باشد که از جمله این آنزیم‌ها می‌توان به SmaI اشاره کرد (شکل فوق قسمت B).

آنزیم هایی که انتهای چسبنده (sticky) می نمایند نیز خود دو نوع می باشد که یک نوع انتهای چسبنده آویزان سمت 5 پریم (5 overhang restriction enzyme ) را ایجاد می نمایند (شکل فوق سمت A)

اما برخی از آنزیم های محدودگر انتهای چسبان 3 پریم (3 overhang restriction enzyme ) ایجاد می نمایند (شکل فوق).

مراحل کلون نمودن ژن ها با استفاده از آنزیم های محدود کننده

اصل کلی در کلون نمودن توالی ها با آنزیم های محدودگر در این است که اگر دو مولکول DNA مختلف با آنزیم محدود کننده‌ی یکسانی برش داده شوند قطعاتی با انتهای چسبنده و مکمل یکدیگر ایجاد می‌شود و به این ترتیب می‌توان انتهای یک DNA (مانند DNA هدف) را با انتهای  DNA دیگر (مانند وکتور) جفت و متصل کرد و DNA نوترکیب ایجاد کرد به این صورت که انتهای چسبنده وکتور و DNA هدف که مکمل یکدیگر می‌باشند به همدیگر متصل می‌شوند.

البته کاربرد انتهای چسبنده به تنهایی برای تولید DNA نوترکیب کفایت نمی‌کند چرا که پیوند بین نواحی تک رشته‌ای از نوع پیوند هیدروژنی  بین بازهای نیتروژنی DNA است و به اندازه‌ی کافی قوی نیست تا دو مولکول DNA را به همدیگر متصل نگاه دارد. برای رفع این مشکل باید پیوند کوالان فسفودی‌استر بین قطعات برقرار کرد که این عمل با به کاربردن آنزیم دیگری به نام «لیگاز» مقدور می‌گردد.

جایگاه کلونینگ چندگانه یا MSC (multiple cloning site) چیست و چه کاربردی در کلونینگ ژن ها دارد

برای آسان‌تر شدن کلونینگ، اغلب وکتورها دارای یک جایگاه به اسم جایگاه کلونینگ چندگانه یا MSC (multiple cloning site) که جایگاه شناسایی چندین آنزیم محدودگر می باشد بنابراین می‌توان با انتخاب آنزیم محدودگر مناسب کلونینگ را انجام داد.

طراحی پرایمر برای کلونینگ ژن ها با استفاده از آنزیم های محدودکننده

با وجود اینکه بر روی وکتورها جایگاه MSC برای ایجاد برش توسط آنزیم های محدود کننده وجود دارد اما در اغلب موارد قطعه‌ای که باید کلون شود فاقد جایگاه شناسایی آنزیمی باشد بنابراین باید با طراحی پرایمرهایی که در سمت 5 پریم دارای جایگاه شناسایی آنزیم های محدود کننده می‌باشند و در حین واکنش PCR این جایگاه‌ها را به توالی مربوطه اضافه نمود.

انواع روش های کلون نمودن ژن ها با استفاده از آنزیم های محدودکننده

بر اساس تعداد آنزیم های محدودگر مورد استفاده در کلونینگ می‌توان فرایند کلونینگ را به دو دسته تقسیم نمود.

در دسته اول از یک آنزیم محدودگر برای برش قطعات استفاده می شود بنابراین در این روش در دو طرف توالی ای که کلون می شود دو جایگاه شناسایی یکسان وجود دارد که توسط یک آنزیم محدودگر برش می‌خورد وکتور نیز توسط همین آنزیم برش زده می شود. بنابراین 4 انتهای چسبنده مشابه ایجاد می شود که دو جایگاه بر روی توالی و دو جایگاه بر روی وکتور قرار دارد این روش دارای چند عیب می‌باشد

اول اینکه وکتور دارای دو انتهای چسبنده مکمل یکدیگر می‌باشد که می‌توانند در فرایند کلونینگ به هم متصل شوند در حالی که هیچ توالی ای درون آن کلون نشده است.

عیب دوم استفاده از یک آنزیم محدودگر در این است که توالی می‌تواند در دو جهت کلون شود. فرض نماید می‌خواهید یک ژن را در کنار یک پروموتر کلون نمایید اما در صورت استفاده از یک آنزیم محدودگر توالی ژن مانند شکل فوق می‌تواند در هر دو جهت کلون شود بنابراین تنها 50 درصد از وکتورهای نوترکیب ایجاد شده می‌توانند ژن مورد نظر را بیان نمایند.

نکته: پروموتر باید در سمت 5پریم ژن ها قرار گیرد تا رونویسی از آن ژن صورت پذیرد.

در روش دوم کلونینگ از دو آنزیم محدودگر برای برش توالی وکتور استفاده می شود. از آنجایی که جایگاه‌ها شناسایی این آنزیم ها با یکدیگر متفاوت می باشد این دو جایگاه نمی‌توانند به یکدیگر متصل شوند و تنها جایگاه‌های چسبنده ایجاد شده توسط یک آنزیم می‌توانند به یکدیگر متصل شوند بنابراین توالی مربوطه تنها در یک جهت کلون خواهد شد.

کلون نمودن چند توالی در یک وکتور با استفاده از آنزیم های محدودگر

شکل فوق اصول کلون نمودن 3 قطعه را با استفاده از آنزیم های محدودگر نمایش می‌دهد. مهم‌ترین قسمت در کلون نمودن همزمان چند قطعه انتخاب آنزیم های محدودگر می باشد. برای کلون نمودن قطعات باید بین هر توالی که به یکدیگر متصل می شود یک قسمت همپوشان که دارای توالی یک آنزیم محدودگر می باشد وجود داشته باشد. توجه داشته باشید که آنزیم های محدودگری که برای اتصال قطعات استفاده می شود باید با یکدیگر متفاوت باشند در غیر این صورت این امکان وجود دارد که برخی از قطعات کلون نشوند و یا در جهت مخالف کلون شوند. برای کلون نمودن توالی ها در وکتور باید بر روی insert ها دو آنزیم محدودگر مشترک با وکتور نیز قرار داد.

اتصال چند قطعه DNA (ژن) با استفاده از آنزیم های محدودگر

اصول اتصال چند قطعه خطی به یکدیگر همانند اصول کلون نمودن چند insert در یک وکتور می باشد. برای اتصال قطعات باید بین قطعاتی که به یکدیگر متصل می شود یک قسمت همپوشان که جایگاه شناسایی یک آنزیم محدودگر می باشد وجود داشته باشد. توجه داشته باشید که آنزیم های محدودگری که برای اتصال قطعات استفاده می شود باید با یکدیگر متفاوت باشند در غیر این صورت این امکان وجود دارد که برخی از قطعات به یکدیگر نشوند.